표피 표현형 점수를 통한 기공 발달에 관여하는 유전자 식별
Summary
이 논문은 기공 발달을 제어하는 유전자를 특성화하기 위해 표피 껍질을 사용하지 않는 두 가지 표현형 방법을 설명합니다. 첫 번째 방법은 톨루이딘 블루 O-염색 식물 표피를 사용하여 기공 표현형을 분석하는 방법을 보여줍니다. 두 번째 방법은 기공 리간드를 식별하고 생물학적 활성을 모니터링하는 방법을 설명합니다.
Abstract
기공은 가스 교환 및 수증기 방출에 관여하는 육상 식물 표면의 작은 구멍이며 그 기능은 식물의 생산성과 생존에 매우 중요합니다. 따라서 기공이 발달하고 패턴화되는 메커니즘을 이해하는 것은 엄청난 농업적 가치를 가지고 있습니다. 이 논문은 기공 발달 및 패턴화를 제어하는 유전자를 특성화하는 데 사용할 수 있는 애기장 대 자엽을 사용하는 두 가지 표현형 방법을 설명합니다. 먼저 톨루이딘 블루 O-염색 자엽을 사용하여 기공 표현형을 분석하는 절차가 제시됩니다. 이 방법은 빠르고 안정적이며 표현형 분석에 널리 사용되지만 전문 교육이 필요한 표피 필링을 사용할 필요가 없습니다. 여러 시스테인 잔기의 존재로 인해 기공 발달에 역할을 하는 생리활성 EPF 펩타이드의 식별 및 생성이 어려웠습니다. 따라서 두 번째로 제시된 절차는 기공 리간드를 식별하고 생물학적 분석에 의해 생물학적 활성을 모니터링하는 데 사용되는 절차입니다. 이 방법의 주요 장점은 펩타이드 용액의 양과 기공 패턴 및 발달을 제어하는 데 있어 펩타이드의 역할을 특성화하는 데 필요한 시간을 줄이면서 재현 가능한 데이터를 비교적 쉽게 생성한다는 것입니다. 전반적으로, 이러한 잘 설계된 프로토콜은 활성을 위해 매우 복잡한 구조가 필요한 시스테인이 풍부한 분비 펩타이드를 포함한 잠재적인 기공 조절자를 연구하는 효율성을 향상시킵니다.
Introduction
식물 기공의 적절한 패턴화와 분화는 광합성과 증산이라는 두 가지 기본적인 생물학적 과정에서의 기능에 매우 중요하며 EPF 펩타이드 신호 전달 경로에 의해 시행됩니다. 애기장대에서 분비된 세 가지 시스테인이 풍부한 펩타이드인 EPF1, EPF2 및 STOMAGEN/EPFL9는 기공 발달의 다양한 측면을 제어하고 ERECTA 계열 수용체 키나아제(ER, ERL1 및 ERL2), SERK 및 TMM 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . 이러한 인식은 MAPK-의존적 과정(11)에 의한 기공 분화를 촉진하는 전사 인자의 하향 조절로 이어진다. 이러한 핵심 기공 유전자의 발견은 주로 표피 결함을 나타내는 돌연변이체의 표현형 스크리닝에 의해 달성됩니다. 이 논문은 기공 패턴 및 분화를 제어하는 잠재적 유전자를 식별하고 특성화하는 데 필요한 기공 및 기타 표피 세포를 시각화하기 위한 비교적 간단하고 효율적인 표현형 분석 방법을 제시합니다.
식물 표피의 세부 사항에 대한 관찰은 일반적으로 톨루이딘 블루 O(TBO) 또는 사프라닌12,13,14과 같은 염료로 염색하거나 염색하지 않고 표피 껍질을 사용하여 달성되었습니다. 그러나 이러한 방법의 주요 과제는 조직을 찢지 않고 잎 표피를 벗겨내고 잎의 다른 부분에서 촬영한 이미지를 피하면서 패턴 데이터를 주의 깊게 관찰하고 분석하기 위한 전문 교육이 필요하다는 것입니다. 클로랄 수화물 기반 투명화 용액과 같은 시약으로 조직 샘플을 투명화하는 화학적 처리는 또한 다양한 범위의 생물학적 물질에 널리 사용되었습니다 8,15; 이러한 처리는 고품질 이미지를 제공하여 많은 표현형 정보를 생성하지만 위험한 화학 물질(예: 포름알데히드, 염소 수화물)의 사용도 필요합니다. 이 논문은 먼저 정량 분석에 충분한 이미지를 생성하지만 샘플 준비를 위해 위험한 화학 물질과 표피 잎 껍질을 사용할 필요가 없는 비교적 쉽고 편리한 표현형 분석 방법을 제시합니다. TBO 염색 자엽 표피는 또한 trichomes의 부족과 자엽의 더 작은 발달 구배가 표피 표현형의 간단하고 다루기 쉬운 해석을 허용하기 때문에 기공 발달 연구에 이상적입니다.
기공 EPF 펩타이드는 상대적으로 큰 성숙 크기와 보존된 시스테인 잔기 사이의 분자내 이황화 결합을 갖는 식물 특이적 시스테인이 풍부한 펩타이드 그룹에 속합니다. 올바른 구조적 폴딩은 생물학적 기능에 매우 중요하지만, 화학 합성 또는 이종 재조합 시스템에 의해 생성되는 시스테인이 풍부한 펩타이드는 비활성일 수 있으며 적절하게 폴딩된 펩타이드와 풀린 펩타이드모두의 혼합물입니다 3,7,16. 따라서 기공 발달을 조절하는 역할을 하는 생리활성 펩타이드의 스크리닝은 매우 어려운 작업이었습니다. 이 원고는 생리활성 기공 펩타이드의 더 나은 식별 및 특성화를 위한 생물학적 분석을 추가로 설명합니다. 이 방법에서, 애기장대 묘목은 6-7일 동안 잠재적인 펩티드가 있거나 없는 배지를 포함하는 다중 웰 플레이트에서 성장합니다. 그런 다음 자엽 표피를 컨포칼 현미경을 사용하여 시각화합니다. 일반적으로, 기공 발달에서 잠재적인 펩타이드의 생물학적 활성을 명확하게 시각화하기 위해, 더 많은 표피 세포를 생성하는 epf2 돌연변이 및 감소된 표피 세포 밀도 2,4,5를 부여하는 STOMAGEN-ami 라인과 같이 더 많거나 적은 기공 계통 세포를 생성하는 유전자형이 생물학적 분석을 위해 야생형 애기장대 대조군(Col-0)에 추가로 사용됩니다.
전반적으로, 여기에 제시된 두 가지 프로토콜은 다양한 표피 표현형의 빠르고 효율적인 평가와 기공 패턴 및 발달을 제어하는 역할을 하는 작은 펩타이드 및 호르몬을 스크리닝하는 데 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 제시된 기공 패턴 및 분화를 제어하는 유전자를 식별하고 특성화하기 위한 두 가지 표현형 분석 방법은 프로토콜이 표피 박리 및 특수 장비(시간이 많이 걸리고 샘플 준비를 위한 특별 교육이 필요함)를 사용할 필요가 없지만 표피 표현형의 정량적 분석을 위한 고품질 이미지를 생성하기 때문에 편리하고 신뢰할 수 있는 분석입니다.
TBO 염색 애기장대 자엽을 사…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 캐나다 천연 자원 및 공학 연구위원회 (NSERC) 디스커버리 프로그램과 Concordia University를 통해 자금을 지원받았습니다. K.B.는 인도의 National Overseas Scholarship의 지원을 받습니다.
Materials
| 18 mm x 18 mm cover slip | VWR | 16004-326 | |
| 24-well sterile plates with lid | VWR | CA62406-183 | |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | Microporous surgical paper tape used to seal MS plates |
| 76 x 26 mm Microscope slide | TLG | GEW90-2575-03 | |
| Acetic acid, ≥99.8% | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | |
| Bleech | Household bleach (e.g., Clorox) | ||
| Confocal microscope | Nikon | Nikon C2 operated by NIS-Elements | |
| Ethanol | Greenfield | P210EAAN | |
| FIJI | Open-srouce | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Gamborg's vitamin mixture | Cassson Labs | GBL01-100ML | Store at 4 °C |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| Growth chambers | Conviron, model E15 | 16h light cycle, set at 21°C with a light intensity of 120 µmol·m-2·s-1. | |
| Lights | HD Supply | 25272 | Fluorescent lights in growth chambers, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 14-222-155 | Tubes in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse TiE equipped with a DsRi2 digital camera | |
| Murashige and Skoog basal salts | Cassson Labs | MSP01-1LT | Store at 4 °C |
| Petri Dish 100 mm x 20 mm | Fisher Scientific | 08-757-11Z | Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana |
| Propidium Iodide | VWR | 39139-064 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 08-916-5A | |
| Sucrose | BioShop | SUC700.5 | |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260-5G | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 |
References
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