Demonstration af DNA-fiberanalysen til undersøgelse af DNA-skader og reparationsdynamik induceret af nanopartikler

Summary

Metoden hjælper med analysen af variation i DNA-replikationsdynamik i nærvær af nanopartikler. Forskellige metoder kan vedtages baseret på cytotoksicitetsniveauet af materialet af interesse. Derudover gives en beskrivelse af billedanalysen for at hjælpe med DNA-fiberanalyse.

Abstract

Eksponering for nanomaterialer kan forårsage replikationsstress og genomisk ustabilitet i celler. Graden af ustabilitet afhænger af nanomaterialernes kemi, størrelse og koncentration, eksponeringstidspunktet og den eksponerede celletype. Flere etablerede metoder er blevet brugt til at belyse, hvordan endogene / eksogene stoffer påvirker global replikation. Imidlertid er analyser på replicon-niveau, såsom DNA-fiberassayet, afgørende for at forstå, hvordan disse midler påvirker replikationsinitiering, termineringer og replikationsgaffelprogression. Når man ved dette, kan man bedre forstå, hvordan nanomaterialer øger chancerne for mutationsfiksering og genomisk ustabilitet. Vi brugte RAW 264.7 makrofager som modelceller til at studere replikationsdynamikken under grafenoxid nanopartikeleksponering. Her demonstrerer vi den grundlæggende protokol for DNA-fiberassayet, som inkluderer pulsmærkning med nukleotidanaloger, cellelyse, spredning af de pulsmærkede DNA-fibre på dias, fluorescerende immunfarvning af nukleotidanalogerne i DNA-fibrene, billeddannelse af replikationsmellemprodukterne i DNA-fibrene ved hjælp af konfokalmikroskopi og replikationsmellemanalyse ved hjælp af en computerassisteret scorings- og analysesoftware (CASA).

Introduction

Under hver cellecyklus sikrer DNA-replikation nøjagtig genomduplikering¹. Eukaryot kromosomal replikation afhænger i det væsentlige af tre faktorer: tidspunktet for affyring af flere replikationsoprindelser, hastigheden af gaflerne, der kommer ud af den fyrede oprindelse, og afslutningen af replikationsprocessen, når to replikationsgafler fra tilstødende oprindelse opfylder². For high-fidelity-transmission af genetisk information til datterceller samt bevarelse af genetisk integritet er nøjagtig DNA-replikation afgørende. Midler, der udvikler sig fra regelmæssig metabolisme eller skyldes kunstige eller naturlige miljømaterialer, angriber konstant genomet. Disse endogene og eksogene midler får replikationsgafler til at bremse eller stoppe på grund af at støde på DNA-skader forårsaget af disse midler, og gaflerne, der midlertidigt bremser eller stopper som reaktion på disse vanskeligheder, kaldes replikationsstress³. Som reaktion på replikationsstress har celler udviklet flere molekylære veje, der opretholder stabiliteten af de forstyrrede replikationsgafler og giver dem mulighed for at genstarte⁴. Med hensyn til genetisk stabilitet, celleoverlevelse og menneskelig sygdom har disse replikationsstressresponsmekanismer vist sig at være nøglefaktorerne for at opretholde et sundt genom, sikre celleoverlevelse og mindske sandsynligheden for sygdomsdannelse⁵.

Et af de eksogene midler, der er i stand til at producere replikationsstress, er nanopartikler. Nanopartikler er partikler, der varierer i størrelse fra 1 nm til 100 nm⁶. På grund af deres høje overfladearealer, karakteristiske former og unikke kemiske egenskaber anvendes nanopartikler i forskellige medicinske, farmaceutiske, miljømæssige og industrielle applikationer ^7,8. Mens nanopartikler har mange potentielle fordele, kan nogle af dem (på grund af deres arvelige natur eller levetid) blive giftige. Nanopartikler kan også dannes på grund af det naturlige slid på medicinske implantater og frigives i det periprotetiske område ^9,10.

På grund af menneskers eksponering for et utal af nanopartikler, der produceres til forskellige anvendelser, er forskningen inden for nanopartikeltoksicitet steget enormt i løbet af de sidste 10 år¹¹. Mens disse forskningsbestræbelser har afsløret oplysninger i overflod om den potentielle trussel, som nanopartikler udgør for menneskers sundhed, er viden om nanopartiklers potentiale til at forårsage genotoksicitet stadig begrænset. Hvad der hidtil er blevet opdaget er, at disse nanopartikler fysisk kan interagere med DNA’et, fremme DNA-skader og beskadige eller forstyrre de proteiner, der er ansvarlige for reparation eller replikering af DNA¹². For at opdage, hvordan de forstyrrer DNA-replikation, anvendes DNA-fiberkæmning, radioresistent DNA-syntese (RDS) og DNA-fiberanalyse typisk^13,14,15,16.

DNA-fiberkæmningsmetoden er fleksibel og giver information om replikationsgaffeldynamik på enkeltmolekyleniveau¹⁷. I det væsentlige trækkes en saltet dæksel forsigtigt ud af DNA-opløsningen, når DNA-enderne binder sig til den. DNA-molekylerne rettes og justeres af opløsningens menisk. Homogeniteten, afstanden og justeringen af DNA-fibrene understøtter nøjagtige og pålidelige målinger af fiberkanallængden. Ved at justere længden og rækkefølgen af behandlingerne og de lægemidler, der bruges til at forårsage stress eller skade, kan mange aspekter af gaffelfremskridt overvåges ved hjælp af denne applikation. I denne metode anvendes et dobbelt mærkningssystem, hvorigennem replikationsgaffelens hastighed og progression vurderes^17,18. På den anden side udnytter 2D-gelelektroforese det faktum, at forgrenings-DNA-strukturer i agarosegelelektroforese bevæger sig langsommere end lineære DNA-molekyler med samme masse, hvilket muliggør ren adskillelse af de to i en 2D-kørsel. Faktisk undersøges denne metode til at adskille DNA-molekyler baseret på deres masse i første løb og baseret på deres form i det andet ortogonale løb. Efter genomisk DNA-fragmentering udvikler de usædvanlige replikations- og rekombinationsmellemprodukter en forgreningsform, og de kan skelnes fra de mere almindelige lineære molekyler i 2D-gel¹⁹.

RDS-metoden bruges til at bestemme, hvordan global DNA-syntese påvirkes. I denne metode bestemmes graden af hæmning af global replikation ved at sammenligne mængden af inkorporerede radioaktivt mærkede nukleotider, såsom [14C] thymidin, i ubehandlede versus behandlede celler^14,20. Den procentvise forskel i radioaktiv mærkning mellem de ubehandlede og behandlede celler repræsenterer i hvilken grad det DNA-skadelige middel påvirker DNA-syntesen. I lighed med dette bruger en anden metode cellernes evne til at integrere nukleotidanaloger som BrdU (5-brom-2′-deoxyuridin) til flowcytometri til måling af de samlede hastigheder af DNA-syntese^21,22. Mens disse metoder demonstrerer, hvordan DNA-skadelige stoffer påvirker global DNA-syntese, viser de ikke, hvordan individuelle replicons påvirkes. Faktisk er analyser på replicon-niveau afgørende for bedre at forstå initieringen og omfanget af genomisk ustabilitet i tilfælde af eksponering for toksiske partikler (nanomateriale). DNA-fiberautoradiografi og elektronmikroskopi er nogle metoder, der bruges til at bestemme denne^23,24,25,26.

Begreberne replikationsbobler og tovejsreplikation fra ujævnt fordelte kilder blev først udviklet ved hjælp af enkeltmolekyletest som elektronmikroskopi og DNA-fiberautoradiografi^27,28. Den direkte observation af forgreningsreplikationsmellemprodukter på specifikke molekyler spredt over et kulstofbelagt gitter lettes i høj grad ved elektronmikroskopi. Denne metode, som stadig er i brug i dag til at spore patologiske skift ved replikationsgafler, blev brugt til at lokalisere den første eukaryote oprindelse af DNA-replikation²⁸. Fiber autoradiografi er centreret omkring begrebet autoradiografisk identifikation af nyligt replikerede områder og pulsmærkning af kromosomer med tritieret thymidin. Den første kvantitative evaluering af oprindelsestætheder og replikationsgaffel i metazoan genomiske sekvenser blev muliggjort af DNA-fiber autoradiografi²⁹.

I øjeblikket har fiberfluorografimetoder taget plads til autoradiografi, hovedsageligt fordi fiberfluorografi er meget hurtigere end autoradiografi. I fiberfluorografi inkorporeres to halogenerede nukleotidderivater, såsom brom- (Br), chlor- (Cl) eller iododeoxyuridin (IdU), sekventielt i frisk replikeret DNA og identificeres derefter ved indirekte immunofluorescens ved anvendelse af antistoffer³⁰. Mikroskopisk visning af det spirende DNA, der har inkorporeret en eller begge analoger, muliggøres ved immunfarvning af en af analogerne i en farve og den anden analog i en anden farve (f.eks. Immunfarvning spirende DNA med inkorporeret IdU-rød og inkorporeret CldU-grøn) (figur 1)²¹. Mange forskellige typer replikationsmellemprodukter kan identificeres ved DNA-fiberanalyse. De mest almindeligt undersøgte er individuelle forlængende gafler, initieringer og afslutninger. Individuelle forlængende gafler har et replikationsmønster af rød efterfulgt af grøn (rødgrøn; Figur 2A). ¹³ Længderne af disse mellemprodukter anvendes ofte til at måle gaffelhastigheden (dvs. gaffellængde/pulstid) eller den eksonukleolytiske nedbrydning af spirende DNA gennem sporforkortelse (figur 2E)^30,31,32. I en undersøgelse af Mimitou et al. blev det konstateret, at ved langvarig eksponering for hydroxyurea, en replikationsgift, der forårsager dobbeltstrengsbrud i DNA’et, blev RE11 rekrutteret³³. MRE11 er en eksonuklease kendt for sin 3′-5′ eksonukleaseaktivitet, og den er i stand til at skære enderne af DNA til reparation. Derfor kan man, når man udsættes for toksiske stoffer, observere eksonukleolytisk nedbrydning af spirende DNA, hvilket er forkortelsen af DNA-strengen på grund af eksponering for et DNA-skadeligt middel³⁴.

Replikationsgaffelbrud forårsaget af fysiske forhindringer (DNA-proteinkomplekser eller DNA-læsioner), kemiske hindringer eller mutationer kan stoppe replikation og nødvendiggøre homolog rekombination for at genstarte den. Dette er kendt som nedsat gaffelprogression. Talrige in vitro- og in vivo-undersøgelser har vist, at transkription lejlighedsvis kan forhindre fremskridt med replikationsgaflen på denne måde³⁵.

Indvielser er replikationsoprindelser, der starter og affyres under den første eller anden puls. Oprindelser, der affyres under den første puls og har replikationsgafler, der fortsat er aktive, har et grøn-rød-grønt mønster (figur 2B, nederst). Oprindelser, der starter under den anden puls, har et kun grønt mønster (figur 2B, øvre) og kaldes undertiden nyligt initieret oprindelse, så disse oprindelser kan skelnes fra dem, der starter under den første puls. Sammenligningen af de relative procentdele af nyligt brændt oprindelse mellem to eksperimentelle betingelser gør det muligt at forstå, hvordan en celle reagerer på et DNA-skadeligt middel eller tilstedeværelsen eller fraværet af et protein. Afslutninger oprettes, når to replikeringsgafler fra tilstødende replicons smelter sammen, og de har et rød-grøn-rødt mønster (figur 2D)³⁰.

Baseret på de ovenfor beskrevne fakta betragtes DNA-fiberanalyse i øjeblikket som en foretrukken metode til at studere variationen i DNA-replikationsdynamik forårsaget af giftige stoffer såsom nanomaterialer. Forskere har nu en god forståelse af og viden om dynamikken i genom-dækkende DNA-replikation i eukaryoter, både kvantitativt og kvalitativt, på grund af opdagelsen af denne teknologi³⁶. Baseret på udfaldsvariablerne kan flere metoder anvendes. Nogle eksempler på metoder til at studere variationerne i DNA-skader induceret af eksterne stoffer/nanopartikler er vist i figur 3. Det overordnede mål med DNA-fiberanalysemetoden beskrevet i denne undersøgelse er at bestemme, hvordan nanopartikler påvirker replikationsprocessen in vitro , og hvordan de forskelligt påvirker forskellige væv.

Protocol

1. Fremstilling af antistoffer og buffer Forbered den primære antistofopløsning, muse-anti-BrdU ved en 1:300 fortynding i 5% BSA og rotte anti-BrdU ved en 1:500 fortynding i 5% BSA. Forbered den sekundære antistofopløsning, alexafluor 594 kanin-antimus ved en 1:300 fortynding i 5% BSA og alexafluor 488 kyllingeanti-rotte ved en 1:500 fortynding i 5% BSA. Forbered den tertiære antistofopløsning, alexafluor 594 ged antikanin ved en 1:1.000 fortynding i 5% BSA og alexaflu…

Representative Results

Efter at have opnået nok billeder (fra 20-100 billeder pr. Tilstand), skal replikationsmellemprodukterne identificeres, måles og tælles. Uanset om man analyserer fibrene manuelt eller automatisk via et program38, er det nødvendigt klart at definere, hvilke egenskaber en fiber skal have, for at den kan tælles eller scores (eller ikke tælles eller måles)39. For eksempel kan følgende spørgsmål overvejes. (1) Skal man kun måle og tælle fibre med 100% immunf…

Discussion

Vi diskuterer her en metode til at hjælpe med analysen af variationen i DNA-replikationsdynamik i nærvær af nanopartikler gennem DNA-fiberassayet. De vigtigste kritiske trin, der er involveret i standardanalysen, er beskrevet i protokollen (trin 2.2.2 og trin 3.1.3). Det anbefales altid at bruge et område med begrænset eksponering for ovenlys og konstant luftstrøm for at forhindre lysinducerede DNA-brud i diasene samt for at forbedre reproducerbarheden. Der kræves omhyggelig opmærksomhed på varigheden af tørrin…

Materials

24 well plate	Fisher brand	FB012929
Acetic Acid	Sigma Aldrich	695092
Alexa flour 594 goat anti-rabbit	Invitrogen	A11037
Alexa fluor 488 chicken anti-rat	Invitrogen	A21470
Alexa fluor 488 goat anti-chicken	Invitrogen	A11039
Alexa fluor 594 rabbit anti-mouse	Invitrogen	A11062
BSA	Sigma Aldrich	A2153
CldU	Sigma Aldrich	50-90-8
Coverslips (22 x 50 mm)	Fisher brand	12-545-EP
EDTA	Fisher Scientific	15575020
Frosted Microscope Slides	Fisher brand	12-550-11
Hydrochloric Acid	Sigma Aldrich	320331
IdU	Sigma Aldrich	54-42-2
Methanol	Fisher Scientific	A454-4
Mouse Anti-BrdU	BD Biosciences	347580
Phosphate Buffer Saline	Gibco	10010072
Rat anti-BrdU	Abcam	BU1–75(ICR1)
Raw 264.5 macrophage cells	ATCC	TIB-71
SDS	Sigma Aldrich	L3771
Silane-Prep slides	Sigma Aldrich	S4651-72EA
Superfrost gold plus slides	Fischer scientific	22-035813
Tris pH 7.4	Sigma Aldrich	77861
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416