Démonstration du test de fibre d’ADN pour étudier les dommages à l’ADN et la dynamique de réparation induits par les nanoparticules

Summary

La méthodologie aide à l’analyse de la variation de la dynamique de réplication de l’ADN en présence de nanoparticules. Différentes méthodologies peuvent être adoptées en fonction du niveau de cytotoxicité du matériau d’intérêt. En outre, une description de l’analyse de l’image est fournie pour aider à l’analyse des fibres d’ADN.

Abstract

L’exposition aux nanomatériaux peut provoquer un stress de réplication et une instabilité génomique dans les cellules. Le degré d’instabilité dépend de la chimie, de la taille et de la concentration des nanomatériaux, du temps d’exposition et du type de cellule exposée. Plusieurs méthodes établies ont été utilisées pour élucider l’impact des agents endogènes/exogènes sur la réplication mondiale. Cependant, les tests au niveau du réplicon, tels que le test de la fibre d’ADN, sont essentiels pour comprendre comment ces agents influencent l’initiation de la réplication, les terminaisons et la progression de la fourche de réplication. Savoir cela permet de mieux comprendre comment les nanomatériaux augmentent les risques de fixation des mutations et d’instabilité génomique. Nous avons utilisé des macrophages RAW 264.7 comme cellules modèles pour étudier la dynamique de réplication sous exposition à des nanoparticules d’oxyde de graphène. Ici, nous démontrons le protocole de base pour le test des fibres d’ADN, qui comprend le marquage par impulsions avec des analogues nucléotidiques, la lyse cellulaire, l’étalement des fibres d’ADN marquées par impulsions sur des lames, l’immunomarquage fluorescent des analogues nucléotidiques dans les fibres d’ADN, l’imagerie des intermédiaires de réplication dans les fibres d’ADN à l’aide de la microscopie confocale et l’analyse intermédiaire de réplication à l’aide d’un logiciel de notation et d’analyse assisté par ordinateur (CASA).

Introduction

Au cours de chaque cycle cellulaire, la réplication de l’ADN assure une duplication précise du génome¹. La réplication chromosomique eucaryote dépend essentiellement de trois facteurs: le moment du déclenchement de plusieurs origines de réplication, la vitesse des fourches qui émergent des origines déclenchées et la fin du processus de réplication lorsque deux fourches de réplication d’origines adjacentes se rencontrent². Pour la transmission haute fidélité de l’information génétique aux cellules filles, ainsi que pour la préservation de l’intégrité génétique, une réplication précise de l’ADN est cruciale. Les agents qui se développent à partir d’un métabolisme régulier ou qui sont dus à des matériaux environnementaux artificiels ou naturels attaquent constamment le génome. Ces agents endogènes et exogènes provoquent le ralentissement ou l’arrêt des fourches de réplication en raison de dommages à l’ADN causés par ces agents, et les fourches ralentissant ou s’arrêtant temporairement en réponse à ces difficultés sont appelées stress de réplication³. En réponse au stress de réplication, les cellules ont développé plusieurs voies moléculaires qui maintiennent la stabilité des fourches de réplication perturbées et leur permettent de redémarrer⁴. En termes de stabilité génétique, de survie cellulaire et de maladie humaine, ces mécanismes de réponse au stress de réplication sont apparus comme les facteurs clés pour maintenir un génome sain, assurer la survie des cellules et réduire la probabilité de formation de la maladie⁵.

L’un des agents exogènes capables de produire un stress de réplication est les nanoparticules. Les nanoparticules sont des particules dont la taille varie de 1 nm à 100 nm⁶. En raison de leurs surfaces élevées, de leurs formes distinctives et de leurs propriétés chimiques uniques, les nanoparticules sont utilisées dans diverses applications médicales, pharmaceutiques, environnementales et industrielles ^7,8. Bien que les nanoparticules aient de nombreux avantages potentiels, certaines d’entre elles (en raison de leur nature héréditaire ou de leur longévité) peuvent devenir toxiques. Des nanoparticules peuvent également se former en raison de l’usure naturelle des implants médicaux et être libérées dans la région péri-prothétique ^9,10.

En raison de l’exposition des humains à une myriade de nanoparticules produites pour diverses applications, la recherche dans le domaine de la toxicité des nanoparticules a considérablement augmenté au cours des 10 dernières années¹¹. Bien que ces efforts de recherche aient révélé une abondance d’informations sur la menace potentielle que représentent les nanoparticules pour la santé humaine, les connaissances sur le potentiel de génotoxicité des nanoparticules sont encore limitées. Ce qui a été découvert jusqu’à présent, c’est que ces nanoparticules peuvent interagir physiquement avec l’ADN, favoriser les dommages à l’ADN et endommager ou interférer avec les protéines responsables de la réparation ou de la réplication de l’ADN¹². Pour détecter comment ils interfèrent avec la réplication de l’ADN, le peignage des fibres d’ADN, la synthèse d’ADN radiorésistante (RDS) et l’analyse des fibres d’ADN sont généralement utilisés^13,14,15,16.

La méthode de peignage des fibres d’ADN est flexible et donne des informations sur la dynamique de la fourche de réplication au niveau de la molécule unique¹⁷. En substance, une lamelle de couverture salinisée est délicatement retirée de la solution d’ADN une fois que l’ADN se lie à elle. Les molécules d’ADN sont redressées et alignées par le ménisque de la solution. L’homogénéité, l’espacement et l’alignement des fibres d’ADN permettent des mesures précises et fiables de la longueur des faisceaux de fibres. En ajustant la durée et la séquence des traitements et des médicaments utilisés pour causer du stress ou des dommages, de nombreux aspects de l’avancement de la fourchette peuvent être surveillés à l’aide de cette application. Dans cette méthode, un système de double étiquetage est utilisé, grâce auquel la vitesse et la progression de la fourche de réplication sont évaluées^17,18. D’autre part, l’électrophorèse sur gel 2D tire parti du fait que, dans l’électrophorèse sur gel d’agarose, les structures d’ADN ramifiées se déplacent plus lentement que les molécules d’ADN linéaires de même masse, ce qui permet la séparation nette des deux dans un cycle 2D. En fait, cette méthode est étudiée pour séparer les molécules d’ADN en fonction de leur masse lors de la première exécution et en fonction de leur forme lors de la deuxième exécution orthogonale. Après la fragmentation de l’ADN génomique, les intermédiaires de réplication et de recombinaison peu communs développent une forme ramifiée, et ils peuvent être distingués des molécules linéaires plus courantes dans le gel 2D¹⁹.

La méthode RDS est utilisée pour déterminer comment la synthèse globale de l’ADN est affectée. Dans cette méthode, le degré d’inhibition de la réplication globale est déterminé en comparant la quantité de nucléotides marqués radioactivement incorporés, tels que la thymidine [14C], dans les cellules non traitées par rapport aux cellules traitées^14,20. La différence en pourcentage de radiomarquage entre les cellules non traitées et traitées représente la mesure dans laquelle l’agent endommageant l’ADN affecte la synthèse de l’ADN. De même, une autre méthode utilise la capacité des cellules à intégrer des analogues nucléotidiques comme BrdU (5-bromo-2′-désoxyuridine) pour la cytométrie en flux afin de mesurer les taux globaux de synthèse de l’ADN^21,22. Bien que ces méthodes démontrent comment les agents endommageant l’ADN ont un impact sur la synthèse globale de l’ADN, elles ne montrent pas comment les réplicons individuels sont affectés. En effet, les tests au niveau du réplicon sont impératifs pour mieux comprendre l’initiation et l’étendue de l’instabilité génomique en cas d’exposition à des particules toxiques (nanomatériaux). L’autoradiographie sur fibre d’ADN et la microscopie électronique sont quelques méthodes utilisées pour déterminer ce^23,24,25,26.

Les concepts de bulles de réplication et de réplication bidirectionnelle à partir de sources inégalement espacées ont d’abord été développés à l’aide de tests à molécule unique comme la microscopie électronique et l’autoradiographie sur fibre d’ADN^27,28. L’observation directe des intermédiaires de réplication ramifiée sur des molécules spécifiques dispersées sur une grille recouverte de carbone est grandement facilitée par la microscopie électronique. Cette méthode, qui est encore utilisée aujourd’hui pour suivre les changements pathologiques aux fourches de réplication, a été utilisée pour localiser la première origine eucaryote de la réplication de l’ADN²⁸. L’autoradiographie par fibre est centrée sur le concept de l’identification autoradiographique des zones nouvellement répliquées et le marquage des chromosomes avec la thymidine tritiée. La première évaluation quantitative des densités d’origine et des taux de fourche de réplication dans les séquences génomiques métazoaires a été rendue possible par l’autoradiographie des fibres d’ADN²⁹.

Actuellement, les méthodes de fluorographie par fibre ont pris la place de l’autoradiographie, principalement parce que la fluorographie par fibre est beaucoup plus rapide que l’autoradiographie. Dans la fluorographie par fibres, deux dérivés nucléotidiques halogénés, tels que le bromo- (Br), le chloro- (Cl) ou l’iododésoxyuridine (IdU), sont incorporés séquentiellement dans l’ADN fraîchement répliqué, puis identifiés par immunofluorescence indirecte à l’aide d’anticorps³⁰. L’observation microscopique de l’ADN naissant qui a incorporé l’un ou les deux analogues est rendue possible par immunomarquage de l’un des analogues dans une couleur et l’autre analogue dans une couleur différente (p. ex., immunomarquage de l’ADN naissant avec rouge IdU incorporé et vert CldU incorporé) (Figure 1)²¹. De nombreux types différents d’intermédiaires de réplication peuvent être identifiés par l’analyse des fibres d’ADN. Les plus couramment étudiés sont les fourches allongées individuelles, les initiations et les terminaisons. Les fourches allongées individuelles ont un motif de réplication de rouge suivi de vert (rouge-vert; Figure 2A). ¹³ Les longueurs de ces intermédiaires sont fréquemment utilisées pour mesurer la vitesse de la fourche (c.-à-d. la longueur de la fourche/temps d’impulsion) ou la dégradation exonucléolytique de l’ADN naissant par raccourcissement de la piste (figure 2E)^30,31,32. Dans une étude de Mimitou et al., il a été constaté que lors d’une exposition à long terme à l’hydroxyurée, un poison de réplication qui provoque des cassures double brin dans l’ADN, RE11 a été recruté³³. MRE11 est une exonucléase connue pour son activité exonucléase 3′-5′, et elle est capable de couper les extrémités de l’ADN pour la réparation. Par conséquent, lorsqu’il est exposé à des agents toxiques, on peut observer une dégradation exonucléolytique de l’ADN naissant, qui est le raccourcissement du brin d’ADN dû à l’exposition à un agent endommageant l’ADN³⁴.

Les ruptures de fourche de réplication provoquées par des obstructions physiques (complexes ADN-protéines ou lésions ADN), des obstacles chimiques ou des mutations peuvent arrêter la réplication et nécessiter une recombinaison homologue pour la redémarrer. C’est ce qu’on appelle la progression altérée de la fourche. De nombreuses études in vitro et in vivo ont indiqué que la transcription peut, à l’occasion, empêcher l’avancement de la fourchette de réplication de cette manière³⁵.

Les initiations sont des origines de réplication qui initient et se déclenchent pendant la première ou la deuxième impulsion. Les origines qui se déclenchent lors de la première impulsion et ont des fourches de réplication qui continuent d’être actives ont un motif vert-rouge-vert (Figure 2B, ci-dessous). Les origines qui commencent au cours de la deuxième impulsion ont un motif vert seulement (Figure 2B, ci-dessus) et sont parfois appelées origines nouvellement initiées, de sorte que ces origines peuvent être différenciées de celles qui commencent pendant la première impulsion. La comparaison des pourcentages relatifs d’origines nouvellement déclenchées entre deux conditions expérimentales permet de comprendre comment une cellule répond à un agent endommageant l’ADN ou à la présence ou à l’absence d’une protéine. Les terminaisons sont créées lorsque deux fourches de réplication de réplicons adjacents fusionnent et qu’elles ont un motif rouge-vert-rouge (Figure 2D)³⁰.

Sur la base des faits décrits ci-dessus, l’analyse des fibres d’ADN est actuellement considérée comme une méthode privilégiée pour étudier la variation de la dynamique de réplication de l’ADN causée par des agents toxiques tels que les nanomatériaux. Les chercheurs ont maintenant une bonne compréhension et connaissance de la dynamique de la réplication de l’ADN à l’échelle du génome chez les eucaryotes, à la fois quantitativement et qualitativement, grâce à la découverte de cette technologie³⁶. Sur la base des variables de résultat, plusieurs méthodologies peuvent être adoptées. Quelques exemples de méthodes pour étudier les variations des dommages à l’ADN induits par des agents externes/nanoparticules sont présentés à la figure 3. L’objectif global de la méthode d’analyse des fibres d’ADN décrite dans cette étude est de déterminer comment les nanoparticules affectent le processus de réplication in vitro et comment elles affectent différentiellement divers tissus.

Protocol

1. Préparation des anticorps et du tampon Préparer la solution d’anticorps primaire, l’anti-BrdU de souris à une dilution de 1:300 dans du BSA à 5 % et l’anti-BrdU chez le rat à une dilution de 1:500 dans du BSA à 5 %. Préparer la solution d’anticorps secondaires, alexafluor 594 lapin anti-souris à une dilution de 1:300 dans 5% BSA et alexafluor 488 poulet anti-rat à une dilution de 1:500 dans 5% BSA. Préparer la solution d’anticorps tertiaires, alexafluo…

Representative Results

Après avoir obtenu suffisamment d’images (de 20 à 100 images par condition), les intermédiaires de réplication doivent être identifiés, mesurés et comptés. Qu’il s’agisse d’analyser les fibres manuellement ou automatiquement via un programme38, il est nécessaire de définir clairement quelles caractéristiques une fibre doit avoir pour qu’elle soit comptée ou notée (ou non comptée ou mesurée)39. Par exemple, les questions suivantes peuvent ê…

Discussion

Nous discutons ici d’une méthode pour aider à l’analyse de la variation de la dynamique de réplication de l’ADN en présence de nanoparticules par le biais du test de la fibre d’ADN. Les principales étapes critiques impliquées dans l’essai standard sont décrites dans le protocole (étape 2.2.2 et étape 3.1.3). Il est toujours recommandé d’utiliser une zone avec une exposition limitée à la lumière zénithale et un flux d’air constant pour éviter les cassures d’ADN induites par la lumière dans …

Materials

24 well plate	Fisher brand	FB012929
Acetic Acid	Sigma Aldrich	695092
Alexa flour 594 goat anti-rabbit	Invitrogen	A11037
Alexa fluor 488 chicken anti-rat	Invitrogen	A21470
Alexa fluor 488 goat anti-chicken	Invitrogen	A11039
Alexa fluor 594 rabbit anti-mouse	Invitrogen	A11062
BSA	Sigma Aldrich	A2153
CldU	Sigma Aldrich	50-90-8
Coverslips (22 x 50 mm)	Fisher brand	12-545-EP
EDTA	Fisher Scientific	15575020
Frosted Microscope Slides	Fisher brand	12-550-11
Hydrochloric Acid	Sigma Aldrich	320331
IdU	Sigma Aldrich	54-42-2
Methanol	Fisher Scientific	A454-4
Mouse Anti-BrdU	BD Biosciences	347580
Phosphate Buffer Saline	Gibco	10010072
Rat anti-BrdU	Abcam	BU1–75(ICR1)
Raw 264.5 macrophage cells	ATCC	TIB-71
SDS	Sigma Aldrich	L3771
Silane-Prep slides	Sigma Aldrich	S4651-72EA
Superfrost gold plus slides	Fischer scientific	22-035813
Tris pH 7.4	Sigma Aldrich	77861
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416