Summary
Organoid-fibroblast co-kulturer gir en modell for å studere in vivo stamcelle nisje. Her beskrives en protokoll for esophageal organoid-fibroblast co-kulturer. I tillegg brukes helmonteringsavbildning til å visualisere fibroblast-organoid-interaksjonen.
Abstract
Epitelstam- og stamceller bidrar til dannelse og vedlikehold av epitelbarrieren gjennom livet. De fleste stam- og stamcellepopulasjoner er gjemt bort på anatomisk forskjellige steder, noe som muliggjør eksklusive interaksjoner med nisjesignaler som opprettholder stammen. Mens utviklingen av epitelorganoidkulturer gir et kraftig verktøy for å forstå rollen som stam- og stamceller i homeostase og sykdom, er samspillet i nisjemiljøet stort sett fraværende, og hindrer dermed identifisering av faktorer som påvirker stamcelleadferd. Fibroblaster spiller en nøkkelrolle i å styre epitelstammen og stamfarens skjebne. Her presenteres en omfattende organoid-fibroblast samkulturprotokoll som muliggjør avgrensning av fibroblast-subpopulasjoner i esophageal progenitorcellefornyelse og differensiering. I denne protokollen beskrives en metode for å isolere både epitelceller og fibroblaster parallelt fra spiserøret. Distinkte fluorescensaktiverte cellesorteringsstrategier for å isolere både esophageal stamceller samt fibroblast-subpopulasjoner fra enten transgen reporter eller villtypemus er skissert. Denne protokollen gir en allsidig tilnærming som kan tilpasses for å imøtekomme isolering av spesifikke fibroblastunderpopulasjoner. Etablering og passering av esophageal epitelial organoid monokulturer er inkludert i denne protokollen, noe som muliggjør en direkte sammenligning med samkultursystemet. I tillegg beskrives en 3D-clearing-tilnærming som muliggjør detaljert bildeanalyse av epitel-fibroblast-interaksjoner. Samlet beskriver denne protokollen en komparativ og relativt høy gjennomstrømningsmetode for å identifisere og forstå esophageal stem cell nisjekomponenter in vitro.
Introduction
Organoider brukes som 3D in vitro-analyser for å karakterisere stam- og stamceller, samt å forstå signalsignalene avledet fra de cellulære komponentene i stamcellenisjen 1,2,3,4. Musesophageal organoider ble først beskrevet i 2014, og flere papirer har identifisert vekstfaktorer, som R-Spondin (RSPO), NOGGIN og epidermal vekstfaktor (EGF), som trengs for å opprettholde og passere esophageal organoider 5,6,7, og hevder at lignende signalsignaler kreves for in vivo fornyelse av stamceller. Imidlertid blir vekstfaktorer ofte lagt til i ikke-fysiologiske konsentrasjoner, noe som resulterer i organoide vekstforhold som ikke nødvendigvis gjenspeiler in vivo-signalmiljøet.
Fibroblaster er heterogene stromale cellepopulasjoner som støtter stamcelleegenskaper i mange stamcellenisjer8. Kombinasjonen av epiteliale stamceller og fibroblaster i samme organoidkultur muliggjør organoiddannelse i reduserte konsentrasjoner av eksogent supplerte vekstfaktorer. Organoide kokultursystemer fra tarm- og leverepitel er beskrevet, men en protokoll for å etablere esophageal organoid-fibroblast co-kulturer er fortsatt fremragende 9,10,11.
I denne protokollen er to fluorescensaktiverte cellesorteringsstrategier (FACS) for fibroblaster fra spiserøret, ved bruk av enten transgene PdgfrαH2BeGFP-mus 12 eller villtypemus med klassisk antistofffarging skissert. Ulike subpopulasjoner av fibroblaster kan isoleres ved hjelp av celleoverflatemarkører etter eget valg, og gir dermed fleksibilitet til protokollen. I tillegg brukes en 3D-fluorescensavbildningsteknikk som bevarer organoid morfologi for å karakterisere fibroblast-organoid-interaksjoner. Organoid clearing gir en rask metode for å øke lyspenetrasjonsdybden i organoider, forbedre visualiseringen av organoid-fibroblastforbindelser og muliggjøre rekapitulering av organoidstrukturen i sin helhet. Denne protokollen kombinerer esophageal organoid co-kultur med en hel mount imaging strategi, som muliggjør funksjonell karakterisering av fibroblast-organoid interaksjon.
Protocol
Dyreforsøk for denne studien ble godkjent av Stockholms Norra djurförsöksetiska nämnd (etisk tillatelse nr. 14051-2019). Dyrene ble plassert i patogenfrie forhold i henhold til anbefalingene fra Federation of European Laboratory Animal Science Association.
1. Forberedelse
- Tine de enzymatiske stamløsningene som brukes til dissosiasjon (se materialtabell) på is. Tine en alikot av vekstfaktorredusert (GFR) kjellermembranmatrise (matrise) ved 4 °C.
- Forbered kulturmediet. Bruk mediet beskrevet i tabell 1 for organoidkulturer og kokulturer og klargjør det før du starter protokollen.
2. Disseksjon og separasjon av esophageal epitel og stroma
MERK: Forsikre deg om at alle instrumenter som brukes til disseksjon og vevsbehandling er sterile. Forbered 2 ml dissosiasjonsløsning (se materialtabell) i Hanks balansert saltløsning (HBSS) per tre spiserør.
- Bruk en valgfri musestamme, for eksempel C57BL/6J-mus. Esophageal utvikling hos mus avsluttes etter postnatal dag (p) 70, så det anbefales å bruke mus som er eldre enn p7013. Bruk fire eller fem mus da de gir tilstrekkelig materiale til å etablere 8-10 organoide samkulturer.
MERK: Organoiddannende effektivitet reduseres med musens alder. Hvis spesifikke fibroblast-subpopulasjoner er av interesse, er det mulig at det lave fibroblastutbyttet begrenser antall organoide kokulturer som kan etableres. - Bruk genetisk modifiserte (f.eks. PdgfrαH2BeGFP) eller villtype (WT) mus for isolering av fibroblastpopulasjoner. Ved bruk av WT-mus, utfør antistofffarging for å isolere spesifikke fibroblastsubpopulasjoner fra stroma via FACS.
- Avlive musene ved CO2 -kvelning. Dissekere spiserøret ved hjelp av tang og disseksjon saks. For å fjerne hele spiserøret, kutt den distale enden av spiserøret rett over magen og den proksimale enden i begynnelsen av luftrøret. Senk spiserøret i PBS og legg det på is.
- Fjern muscularis externa mekanisk ved hjelp av et disseksjonsmikroskop (totalt forstørrelsesområde på 8x-40x) og tang. Hold den distale enden av den dissekerte spiserøret ved hjelp av ett par tang og bruk de andre tangene til å gripe og trekke muskelen fra den distale til den proksimale enden av dissekert spiserør. Fjern og kast muskellaget.
- Åpne spiserøret i lengderetningen. Dette fungerer best ved hjelp av mikrodisseksjonsfjærsaks med kulespiss for å forhindre vevskader. Hold den ene enden av spiserøret for å sette ballen på vårsaksen inn i spiserørets lumen og kutte opp spiserøret mens du holder på enden.
- Plasser spiserøret i et 1,5 ml mikrosentrifugerør eller en 24-brønnsplate. Inkuber den åpnede spiserøret i 0,5 mg / ml termolysin i HBSS ved 37 ° C på en rocker-shaker i 15 minutter. Senk spiserøret helt i termolyseoppløsning.
MERK: Volumet av termolyseoppløsning som brukes, avhenger av brønnen eller rørstørrelsen. Flere esophagi kan plasseres og nedsenkes i samme brønn eller rør. - Ta ut spiserøret fra termolysinoppløsningen. Bruk et disseksjonsmikroskop for å forsiktig skille esophageal epitel fra stroma. Bruk fine tang, ta tak i både epitelsiden og stromasiden av vevet og trekk dem sakte fra hverandre for å skille de to lagene.
MERK: Stroma er identifisert ved sitt hvite og ugjennomsiktige utseende, i motsetning til det gjennomsiktige epitelet. Stroma inneholder lamina propria og submukosal lag. - Overfør epitel- og stromallaget til to separate 1,5 ml mikrosentrifugerør med 200 μL dissosiasjonsløsning i HBSS. Legg på is.
3. Isolering av esophageal stamceller
MERK: Isoleringen av esophageal stamceller (trinn 2) og fibroblaster (trinn 3) kan utføres samtidig. Forbered et 50 ml rør med 1% FBS i HBSS (1% FBS).
- Overfør det separerte esophageal epitelet fra 1,5 ml mikrosentrifugerøret (trinn 2,8) til en ren petriskål og bruk en skarp skalpell til å hakke. Samle hakket vev fra petriskålen med 200 μL dissosiasjonsløsning og overfør det tilbake til 1,5 ml mikrosentrifugerøret.
MERK: Epitelet hakkes ordentlig når bitene kan plasseres tilbake i 1,5 ml mikrosentrifugerøret ved hjelp av en 200 μL pipettespiss. - Tilsett 800 μL fersk dissosiasjonsløsning til 1,5 ml mikrosentrifugerøret til et totalt volum på 1 ml.
MERK: Det er viktig å legge til et tilstrekkelig volum av dissosiasjonsløsning. Per en til tre esophagi anbefales 1 ml oppløsning. Skaler opp når flere spiserør behandles samtidig. - Plasser røret med det hakkede epitellaget på en vipperrister ved 37 °C i 60 minutter. Pipetter oppløsningen opp og ned ca. 20 ganger ved hjelp av en 200 μL pipettespiss hvert 15. minutt for å forbedre fordøyelsen.
- Etter 60 minutter pipetter du opp og ned ytterligere 20 ganger ved hjelp av en 200 μL pipettespiss. Før oppløsningen gjennom en 40 μm cellesil inn i et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør. Sentrifuge ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C.
MERK: Fukt cellesilen med 1% FBS før du strekker cellene for å minimere adherens av cellene til filteret. Epitelet blir ikke fullstendig fordøyd, og biter av vev vil fortsatt være synlige. Lengre inkubasjon vil imidlertid redusere celleoverlevelsen og ikke resultere i et høyere utbytte av levedyktige celler. - Kast supernatanten ved å fjerne overflødig væske med en 1 ml pipette og resuspender pelleten i 1 ml 1 % FBS. Sentrifuge ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C.
- Under sentrifugering, klargjør den konjugerte antistoffblandingen for FACS av esophageal progenitorceller.
- Bland 1 μL CD324-PE-Cy7 (ECADHERIN) og CD104-A647 (INTEGRIN-β4) i 200 μL 1% FBS per en million celler.
MERK: 1 μL antistoff (200 μL endelig volum) er tilstrekkelig for en eller to øsofagi. Når du behandler flere esophagi samtidig, øker volumet av antistofffargingsløsningen.
- Resuspender pelleten i 200 μL antistoffblanding og overfør til et flowcytometrirør. Etter å ha tilsatt fluorescerende antistoffer, hold cellesuspensjonene i mørket for å unngå bleking av signal. Inkuber cellene i 30 minutter ved 4 °C. Tilsett 3 ml 1% FBS og sentrifuge ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C, og resuspender deretter cellene i minimum 200 μL på 1% FBS.
MERK: 500 μL av 1% FBS brukes til opptil fire eller fem spiserør. Øk volumet når flere esophagi behandles samtidig, slik at en FACS-strømningshastighet på 100-300 hendelser / s kan oppnås. Flere hendelser/er vil redusere sorteringseffektiviteten, og en økning i strømningshastigheten vil redusere cellenes overlevelse. - Legg dødcelleflekkmarkør til en endelig konsentrasjon på 1: 10,000, 5 minutter før FACS-sortering for å isolere levende celler. Sorter stamcellene ved hjelp av en FACS-maskin (se figur 1 for gatingstrategi). Samle cellene i 1,5 ml mikrosentrifugerør fylt med 200 μL basisk organoidmedium (tabell 1).
4. Isolering av fibroblaster fra stromallaget
- Klipp stomilaget i fine biter i et 1,5 ml rør inneholdende 200 μL dissosiasjonsløsning (trinn 2,8) ved hjelp av disseksjonsaks. Vevet er riktig kvernet når oppløsningen kan pipetteres opp og ned ved hjelp av en 200 mikrol pipettespiss.
- Tilsett 800 μL fersk dissosiasjonsløsning til 1,5 ml mikrosentrifugerøret til et totalt volum på 1 ml.
MERK: Det er viktig å legge til et tilstrekkelig volum av dissosiasjonsløsning. Per en til tre esophagi anbefales 1 ml oppløsning. Skaler opp når flere spiserør behandles samtidig. - Legg røret på en vippe-shaker ved 37 °C i 30 minutter. Etter 15 minutter pipetterer du oppløsningen opp og ned ca. 20 ganger ved hjelp av en 200 mikrol pipettespiss for å forbedre fordøyelsen.
- Etter 30 minutter med enzymatisk fordøyelse, pipett opp og ned ytterligere 20 ganger ved hjelp av en 200 μL pipettespiss. Sil oppløsningen gjennom en 70 μm cellesil inn i et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør. Sentrifuge ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C.
MERK: Fukt cellesilen med 1% FBS før du strekker cellene for å minimere adherens av celler til filteret. - Kast supernatanten ved å fjerne overflødig væske med en 1 ml pipette og resuspender pelleten i 1 ml 1 % FBS. Sentrifuge ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C.
MERK: Når du bruker en genetisk modifisert musestamme som inneholder blomstrende merket fibroblaster, er antistofffarginger valgfrie. Hvis antistofffarging ikke er nødvendig, fortsett med trinn 3.7 og overfør prøven til et flowcytometrirør.- Under sentrifugering, klargjør den konjugerte antistoffblandingen for FACS-isolering av fibroblaster. Bland 1 μL CD26-APC (DPP4) i 200 μL med 1% FBS per en million celler.
MERK: 1 μL antistoff er tilstrekkelig for en eller to esophagi. Når du behandler flere esophagi samtidig, øker volumet av antistofffargingsløsningen.
- Under sentrifugering, klargjør den konjugerte antistoffblandingen for FACS-isolering av fibroblaster. Bland 1 μL CD26-APC (DPP4) i 200 μL med 1% FBS per en million celler.
- Resuspender pelleten i 200 μL konjugert antistoffblanding i 1% FBS og overfør til et flowcytometrirør. Inkuber cellene i 30 minutter ved 4 °C.
- Tilsett 3 ml 1 % FBS og sentrifuge ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C. Resuspender cellene i minst 200 μL på 1% FBS.
MERK: 500 μL av 1% FBS brukes til opptil fire eller fem spiserør. Øk volumet når flere spiserør behandles samtidig, slik at en strømningshastighet på 100-300 hendelser/s kan oppnås. Flere hendelser vil redusere sorteringseffektiviteten, og økt strømningshastighet vil redusere celleoverlevelsen. Etter tilsetning av fluorescerende antistoffer, bør cellesuspensjoner holdes mørke for å unngå bleking av signal. - Legg dødcelleflekkmarkør til en endelig konsentrasjon på 1: 10,000, 5 minutter før FACS-sortering for å isolere levende celler. Sorter cellene ved hjelp av en FACS-maskin (se figur 1 for gatingstrategi). Samle cellene i 1,5 ml mikrosentrifugerør fylt med 200 μL basisk organoidmedium (tabell 1).
5. Etablering og kultur av esophageal organoider
MERK: Forvarm ERlav (organoid kokultur), ENR (organoid) medium (se tabell 1 for beskrivelse), og en 48-brønns plate ved 37 ° C. Plasser den tinte matriksen (tilberedt i trinn 1) alikot på is. Det anbefales å bruke matrisen som er gitt her (se Materialtabell) for musesophageal organoid kultur, siden andre merker av matrise negativt påvirker organoidformingseffektiviteten.
- For organoid samkultur, bland de sorterte epitelceller og fibroblaster i forholdet 1: 2 i et rør. For hver matrikskuppel, bruk 5000 epitelceller og 10.000 fibroblaster. Når du forbereder deg på flere kupler, legg til et multiplum av 5000 epitelceller og 10.000 fibroblaster til ett rør. For organoidkulturer uten fibroblaster, bruk 5000 epitelceller per matrikskuppel.
- Sentrifuge blandingscellepopulasjonen ved 300 x g i 5 minutter. Kast supernatanten ved å fjerne den forsiktig med en pipette på 200 μl.
- Vask cellene en gang ved å resuspendere pelleten i kaldt basisk organoid medium og sentrifuge ved 300 x g i 5 minutter. Plasser cellene på is.
- Forbered en blanding bestående av 80% matrise og 20% kaldt basisk organoid medium. Legg alt på is når matrisen stivner ved romtemperatur (RT).
- Kast supernatanten etter sentrifugering ved å fjerne den forsiktig med en pipette på 200 μL. Resuspender cellene i 10 μL matriksblanding/kuppel og legg tilbake på is.
- Ta den forvarmede 48-brønnsplaten fra 37 °C-inkubatoren og lag en matrikskuppel per brønn ved hjelp av en 20 μL pipette. Hver kuppel inneholder 10 μL 80% matrise, 5000 epitelceller og 10.000 fibroblaster. Overfør platen opp ned til en kuvøse og la kuplene stivne i ytterligere 20-30 minutter ved 37 °C.
MERK: En reduksjon i matrikskuppelvolum og / eller en økning i cellenummer vil påvirke organoidformingseffektiviteten. - Tilsett 200 μL forvarmet ERlavt medium (tabell 1) til matrikskuplene som inneholder organoide kokulturer og ENR-medium (tabell 1) til de respektive matrikskuplene som bare inneholder epitelorganoider og plasser platen i inkubatoren.
- Dyrk organoidene ved 37 °C og 5 %CO2. For de første 2 dagene, supplere mediet med 10 μM Rock-inhibitor (Y-27623). Rockinhibitor forhindrer stressindusert celledød og øker sjansen for en vellykket etablering av organoidkulturer.
- Oppdater mediet hver 2-3 dag. Forsikre deg om at mediet er varmt for å forhindre dissosiasjon av den temperaturfølsomme matrisen.
- Utfør analyser av eksperimentet 6 til 8 dager etter plating. Organoidene kan oppbevares i kultur i opptil 14 dager. Rundt dag 14 observeres tap av kuppelintegritet.
6. Passasje av organoider
MERK: Passasjering av organoider dyrket i kokultur resulterer i tap av fibroblaster. Derfor anbefales det å bruke ENR-medium for alle organoider når det passeres. Forvarm ENR, PBS og en 48-brønns plate ved 37 °C.
- Fjern mediet og vask brønnen som inneholder matrikskuppelen med forvarmet PBS. Tilsett 200 μL kald 0,25% trypsinløsning og pipette opp og ned for å bryte matrikskuppelen.
MERK: Bruk av kaldt 0,25% trypsin anbefales, da matrisen er temperaturfølsom og dette hjelper til med å bryte ned matrikskuplene. - Inkuber organoidene med trypsin ved 37 °C i ~20 minutter. Pipette opp og ned etter 10 minutter for å øke dissosiasjonen av organoider. Overvåk dissosiasjonsprosessen med et mikroskop hvert 5-10 minutt. Siden trypsin reduserer cellens levedyktighet, kan dette bidra til å identifisere den ideelle dissosiasjonstiden.
- Etter 20 minutter pipetterer du organoidene opp og ned med en 200 μL pipette for å dissosiere organoidene. Samle cellene i et 1,5 ml mikrosentrifugerør, tilsett 1 ml basisk organoidmedium og sentrifuge ved 300 x g i 5 minutter ved RT.
- Valgfritt: For å sikre best organoid vekstforhold og at nye organoider er avledet fra enkeltceller, sil cellene gjennom en forfuktet 40 μm cellesil. Filtrering av cellesuspensjonen resulterer i fjerning av organoidkjerner og celleklumper som er vanskelige å dissosiere.
- Forbered en matriseblanding bestående av 80% matrise og 20% kaldt basisk organoid medium. Legg alt på is, da matrisen stivner ved RT.
- Kast supernatanten ved å fjerne den forsiktig med en 200 μL pipette, resuspendere cellene i 10 μL matriksblanding/kuppel og legge blandingen tilbake på is.
MERK: Organoider kan deles i forholdet 1: 5 til 1: 10, avhengig av kuppeltetthet. Epitelceller kan også telles og re-plated på 5,000 celler / kuppel. - Ta den forvarmede 48-brønnsplaten fra 37 °C-inkubatoren og lag en kuppel per brønn. Overfør platen opp ned til en kuvøse og la kuplene stivne i ytterligere 20-30 minutter ved 37 °C.
- Tilsett 200 μL forvarmet ENR-medium til de respektive organoidkuplene. Suppler mediet med 10 μM steinhemmer (Y-27623) de første 2 dagene.
- Oppdater mediet hver 2-3 dag. Forsikre deg om at mediet er varmt for å forhindre dissosiasjon av den temperaturfølsomme matrisen.
7. Organoidbehandling for helmonteringsfarging
MERK: Belegg spissene og rørene med 10% FBS i PBS før bruk for å unngå organoider som fester seg til plast. For pipettespisser er det tilstrekkelig å pipette en eller to ganger opp og ned i 10 % FBS/PBS-oppløsning før spissen brukes. For rør, fyll røret med 10% FBS / PBS og fjern deretter løsningen.
- Fjern organoidmediet og tilsett 200 μL iskald PBS til matrikskuplene. Legg platen på is i 5-10 min.
- Pipett opp og ned og overfør oppløsningen til 0,6 ml mikrosentrifuge ikke-adherente rør. Sentrifuge kort i 30-60 s ved 100 x g for å la organoidene slå seg ned i bunnen.
MERK: Overflødig pipettering og lang sentrifugering bryter organoider og forstyrrer fibroblast-organoid interaksjon. - Fjern overflødig væske og tilsett iskald PBS. Sentrifuge kort i 30-60 s ved 100 x g for å la organoidene slå seg ned i bunnen.
- Fjern overflødig væske og fiks organoiden med 200 μL kald 4% formaldehyd i PBS-oppløsning i 30 minutter på is.
FORSIKTIG: Formaldehyd er giftig og må alltid brukes i en kjemisk avtrekkshette. Nitrilhansker, vernebriller og laboratoriefrakker må alltid brukes. - Fiksering av organoid får dem til å synke, og sentrifugering er ikke nødvendig lenger. La organoidene synke ved å plassere røret oppreist og vent 2-3 minutter, fjern formaldehydet og tilsett 500 μL kald PBS for å vaske bort formaldehydet.
- La organoidene synke, fjern overflødig PBS og tilsett 500 μL frisk kald PBS. La organoidene synke, fjern overflødig PBS og tilsett 500 μL blokkeringsbuffer (5% normalt eselserum, 1% BSA og 0,5% Triton X-100 i PBS). Sett røret på en rocker-shaker i 60 min på RT.
MERK: Blokkering kan også gjøres over natten (O/N) ved 4 °C. - La organoidene synke, fjern blokkeringsbufferen og resuspender organoidene i 200 μL blokkeringsbuffer med primære antistoffer (se materialtabell). Hold organoidene på en rocker-shaker O/N ved 4 °C.
MERK: For å forbedre fargingen av nukleære proteiner, lavuttrykte proteiner eller antistoffer som viser uspesifikk farging, kan inkubasjonstiden økes i 1 eller 2 dager ved 4 °C. Plassering av organoider på en rocker-shaker er viktig, da det forhindrer organoider i å klumpe seg sammen og øker fargeeffektiviteten. - La organoidene synke, fjern den primære antistoffblandingen og vask organoidene med 500 μL 0,02% Triton X-100 i PBS (0,02% Tx) i 60 minutter ved RT. Gjenta tre ganger.
MERK: Når det er behov for lengre primær antistoffinkubasjon, tilsett et vasketrinn med 0,02 % Tx i PBS O/N ved 4 °C. - La organoidene synke, fjern vaskebufferen og tilsett 200 μL fluorescenskonjugert sekundært antistoff i blokkeringsbuffer O/N ved 4 °C. Etter å ha tilsatt fluorescerende sekundære antistoffer, hold organoider i mørket for å unngå bleking av signal.
- La organoidene synke, fjern den sekundære antistoffblandingen og vask organoidene med 500 μL 0,02% Tx i 60 minutter ved RT. Gjenta tre ganger.
- Motflekk organoidene med 200 μL DAPI (0,25 μg / ml) løsning for kjernefysisk farging om nødvendig. Inkubere prøvene i 60 min på RT på en rocker-shaker.
- La organoidene synke, fjern DAPI-oppløsningen og vask organoidene i 500 μL PBS i 15 minutter ved RT. Gjenta tre ganger.
- La organoidene synke og fjern all overflødig væske. Tilsett 10 μL ryddeoppløsning til organoider og inkuber i 15 minutter ved RT.
MERK: Renseløsningen er tyktflytende, så klipp av den ytre delen av en 20 μL pipettespiss før du pipetterer tømmeoppløsningen. Mer ryddeløsning kan legges til hvis en større avstandsstykke brukes til avbildning. Monteringsløsning kan brukes i stedet for ryddeløsningen når organoider ikke ryddes. Ryddeløsningen reduserer bakgrunnen ved avbildning og øker bildedybden. - Plasser en 0,05 mm dobbeltsidig klebrig 4-brønns avstandsstykke på et mikroskoplysbilde. Tilsett 10 μL ryddeoppløsning med organoider i en brønn og legg en dekselglid på toppen av avstandsstykket.
MERK: Organoider kan også monteres uten bruk av et avstandsstykke. Avstandsstykket holder organoidformen intakt og forhindrer at organoidene blir flatt. - Hold lysbildet på RT O / N for å fjerne organoider. For langtidsoppbevaring, hold lysbildene på 4 °C. Skaff bilder ved hjelp av et konfokalmikroskopisystem.
Representative Results
Spiserøret er delt inn i forskjellige lag: epitel, lamina propria, submukosa og muscularis externa (figur 1A). Fibroblaster ligger innenfor submukosa og lamina propria, referert til som stroma. I denne protokollen fjernes muscularis externa mekanisk (figur 1B), noe som ikke fører til tap av fibroblaster (PdgfrαH2BeGFP+) bosatt i stroma (figur 1C). Før dissosiasjon separeres epitelet fra stroma, noe som resulterer i to vevssegmenter (figur 1B). Å skille de to lagene gir mulighet til å øke dissosiasjonstiden for det mer robuste epitellaget sammenlignet med det skjøre stromale laget. På denne måten etableres en effektiv isolasjonsprotokoll som gir både levedyktige epiteliale stamceller så vel som stromale fibroblaster (figur 1B). Esophageal stamceller sorteres basert på deres høye INTEGRIN-β4 og E-CADHERIN uttrykk (figur 1C,D).
Subpopulasjoner av fibroblaster kan isoleres ved å bruke forskjellige markører. I denne protokollen er det gitt en strategi for fibroblastisolering basert på vanlige fibroblastmarkører PDGFRα og DPP4 (CD26). Isolering av enten PdgfrαH2BeGFP-reporteruttrykk eller DPP4-antistoff viser at rundt 50% av de isolerte cellene er fibroblaster (figur 1E,F). I tillegg er 70% av PDGFRα+ fibroblastene DPP4+, noe som indikerer at en stort sett overlappende, men ikke identisk, fibroblastpopulasjon oppnås. Etter å ha isolert både epitel- og stromale cellepopulasjoner, blir esophageal progenitorceller enten dyrket alene eller sammen med fibroblaster i en matrikskuppel. For å studere fibroblasters bidrag til organoiddannelse, opprettholdes samkulturen i et vekstfaktorredusert medium (figur 1G).
Esophageal stamceller danner organoider i nærvær av EGF, NOGGIN og RSPO (ENR). Fjerne NOGGIN og redusere mengden RSPO (25 ng / μL; ERlav) er tilstrekkelig til å forhindre organoiddannelse (figur 2A). Interessant, tilsetning av enten DPP4 + eller PDGFRα + fibroblaster til esophageal stamceller i ERlavt medium gjenoppretter organoid formingsevne, og demonstrerer en støttende funksjon for begge fibroblastpopulasjoner (figur 2A-D). Visualisering av PdgfrαH2BeGFP-transgenet viser at fibroblaster er i nær kontakt med epiteliale stamceller under organoiddannelse (figur 2A). Ved dag 6 er PdgfrαH2BeGFP+ fibroblaster fortsatt rikelig tilstede i kokulturen. Fibroblaster er tilstede i hele kuppelen, nær og berører organoider (full pil), eller festet til organoider (pilspiss; Figur 2D).
Helmonteringsfarging viser en 3D-representasjon av vekselvirkningen mellom fibroblastene og organoidene (figur 3). Selv om det er mulig å utføre hele monteringsprotokollen uten bruk av en clearingløsning, reduserer den gjennomsiktigheten og laserpenetrasjonen av organoiden (figur 3B, z-view). Ved montering av organoider bidrar avstandsstykket til å opprettholde organoid morfologi. I motsetning til dette flater plating av dekselet direkte på organoidene (uten avstandsstykke) organoidene og resulterer i tap av organoidstruktur (figur 3A, B).
Både DPP4 + og PDGFRα + fibroblaster er funnet å være viklet rundt organoider (figur 3C, Video1 og Video 2). Differensiering av esophageal organoider kan vurderes ved hjelp av forskjellige markører. Figur 4 viser at den medfølgende fargeprotokollen er egnet for keratiner som er lettere å flekke (KRT14/13) samt transkripsjonsfaktorer som er vanskeligere å flekke (TRP63/KLF4). Kokulturprotokollen genererer organoider med et lignende differensieringsmønster, som demonstrert in vivo13,14 og som sett i organoider dyrket i ENR-medium; KRT14+ eller TRP63+ stamceller danner det ytre laget og KRT13+ eller KLF4+ differensierte celler orienterer seg innover.
Denne protokollen gir et verktøy for å studere esophageal stamcellenisje in vitro og visualiserer samspillet mellom organoider og fibroblaster. Ved å implementere en protokoll for isolering av fibroblaster ved bruk av antistoffer, er metoden tilpasningsdyktig og kan brukes til å studere fibroblastunderpopulasjoner uten behov for transgene mus.
Figur 1 Isolering av stamceller og fibroblastsubpopulasjoner fra spiserør. (A) Skjematisk oversikt over de ulike lagene i spiserøret. Stroma inneholder lamina propria og submucosa. (B) Skjematisk oversikt over isolasjonsprotokollen. Muskelen (muscularis externa) fjernes mekanisk ved hjelp av tang; Den gjenværende spiserøret er kuttet åpen og inkubert i termolysin for å skille epitellaget fra stroma. Epitelet og stroma separeres, hakkes mekanisk og fordøyes enzymatisk til enkeltcellesuspensjoner. Dissosierte celler blir deretter farget og forberedt på FACS. (C) Tverrsnitt av spiserøret strippet fra muscularis externa som viser PdgfrαH2BeGFP+ fibroblaster i stroma. INTEGRIN-β4 (ITGβ4) og E-CADHERIN (ECAD) dobbeltpositive celler er epiteliale stamceller i spiserøret. Skala bar = 100 μm. (D) Representativ flowcytometriplott av epitelcelleisolasjon som viser prosentandelen levende celler (øvre panel) fra alle enkeltceller. Det nedre panelet viser prosentandelen av isolerte ITGβ4+ ECAD+ progenitorceller (Prog.) fra alle levende celler. (E) Representativt flowcytometriplott for stromalcelleisolasjon som viser prosentandelen levende celler (øvre venstre panel). Representative flowcytometriplott som viser prosentandelen av isolerte DPP4+ fibroblaster (Fibr.; øvre høyre panel) og Pdgfrα+ fibroblaster (nedre venstre panel) av alle levende celler. 70% av Pdgfrα+ fibroblastene er også DPP4+ (nedre høyre panel). (F) Representativt flowcytometriplott av stroma som bare viser DPP4+-celler (2,5 %), DPP4+ PDGFRα+-celler (37,5 %) og PDGFRα+-celler (17,7 %). Prosentandelene er av alle levende celler. (G) Epitelceller er belagt i en matrikskuppel i nærvær av 50 ng / μL EGF, 100 ng / μL NOGGIN og 250 ng / μL RSPO (ENR), eller sammen med fibroblaster i nærvær av EGF og en lav konsentrasjon av RSPO (25 ng / μL). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative resultater av organoide kokulturer. (A) Brightfield-bilder som viser vekst av organoider fra dag 1 til dag 6. Brightfield-bildene med organoider co-dyrket med PdgfrαH2BeGFP + fibroblaster viser også det nukleære eGFP-signalet. Skalastang = 25 μm. (B) Brightfield-bilder av hele matrisekuppelen på dag 6. Den venstre kolonnen viser organoide kokulturer dyrket i nærvær av Pdgfrα+ fibroblaster i ER lav eller E lavRlav medium. Den midterste kolonnen viser organoide kokulturer dyrket i nærvær av DPP4+ fibroblaster i ER lav ellerE lav Rlav medium. Høyre søyle viser organoide monokulturer dyrket i ENR-medium. ENR medium = EGF (50 ng / μL), NOGGIN (100 ng / μL) og RSPO (250 ng / μL). ERlav = EGF og 25 ng / μL RSPO. E lavRlav = 5 ng / μL EGF og 25 ng / μL RSPO. Skala bar = 500 μm. (C) Graf som viser organoidformingseffektiviteten (%) (dvs. prosentandelen celler som danner organoider under forskjellige kulturforhold). Hver prikk representerer en matrisekuppel, og linjen representerer gjennomsnittet av alle prikker per betingelse. (D) Brightfield og fluorescerende bilde av dag 6 organoider dyrket sammen med PdgfrαH2BeGFP + fibroblaster. PdgfrαH2BeGFP + fibroblaster er tilstede i hele kuppelen, festet til organoider (pilspiss), og ikke festet, men i kontakt med organoider (full pil). Skala bar = 250 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Fargeprotokoll for hele montering for studier av fibroblast-organoid-interaksjoner . (A) Skjematisk oversikt over hele mount immunfluorescensprotokollen. AB = antistoff. (B) Immunfluorescensbilde av uklarert helmonteringsfarging som viser redusert gjennomsiktighet og penetrasjon av laserlyset sammenlignet med de ryddede organoider. Fraværet av et avstandsstykke resulterer i flattning av organoid og tap i organoid morfologi. (C) Hele monteringsbilder av de samdyrkede organoidene viser 3D-overflater av organoider med VIMENTIN + fibroblaster (Fibr.) pakket rundt og i nær kontakt med organoiden. 3D-tverrsnitt og 2D-planbilder viser organoidens lumen. Skala bar = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Helmonterte bilder avslører distinkte basale og suprabasale cellepopulasjoner. (A) Helmonteringsfarging av mono- og kodkulturerte organoider med PdgfrαH2BeGFP+ fibroblaster som viser KRT14+ basalceller i ytre lag og KRT13+ differensierte suprabasale celler. Skala bar = 50 μm. (B) Helmonteringsfarging av mono- og kodyrkede organoider med PdgfrαH2BeGFP+ fibroblaster som viser TRP63+ basalceller i det ytre laget og KLF4+ differensierte suprabasale celler. Skala bar = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Tabell som beskriver komponentene i organoide dyrkningsmedier. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Video 1: PdgfrαH2BeGFP+ fibroblast viklet rundt og i nær kontakt med organoiden. Videoen følger med det øvre panelet i figur 3C. Skalalinjen i figur 3C er 50 μm, og organoiden er ~ 120 μm i diameter. VIMENTIN er vist i hvitt, E-CADHERIN i rødt, PdgfrαH2BeGFP i grønt og DAPI i blått. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 2: DPP4 + fibroblast pakket rundt og i nær kontakt med organoid. Videoen følger med det nedre panelet i figur 3C. Skalalinjen i figur 3C er 50 μm, og organoiden er ~ 120 μm i diameter. VIMENTIN er vist i hvitt, E-CADHERIN i rødt og DAPI i blått. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Discussion
Protokollen som presenteres her etablerer en in vitro-modell for å undersøke funksjonelle esophageal epitel-fibroblastinteraksjoner.
Epitellaget er skilt fra stroma, noe som muliggjør en optimalisert dissosiasjonsprotokoll for både epitel- og stromalrommet. Til tross for optimalisering av epiteldissosiasjonsprotokollen, forblir vevsklumper tydelige. Pipettering opp og ned kraftig hvert 15. minutt reduserer antallet og størrelsen på klumper betydelig. Andre protokoller bruker trypsin for å dissosiere epitellaget 5,6 ytterligere. Her anbefales ikke bruk av trypsin, eller økning av dissosiasjonstiden ytterligere, da dette har en tendens til å resultere i redusert epitelcelle levedyktighet og organoidformingseffektivitet. I motsetning til epitelet blir stroma lett dissosiert, og 30 minutter i dissosiasjonsløsning resulterer i en enkeltcellesuspensjon med ~ 90% fibroblast levedyktighet (figur 1E). Ekskludering av epithelial-stomal separasjonstrinnet i protokollen øker dissosiasjonstiden betydelig, noe som resulterer i redusert fibroblastlevedyktighet og lavere utbytte av epitelceller. I tillegg gir separering av epitelet fra stroma en mulighet til å bestemme celletall for hver populasjon og blande epitelceller og fibroblaster fra forskjellige muselinjer når du setter opp samkulturer.
Studier av fibroblastfunksjon på organoid vekst er en vanlig brukt metode i stamcellebiologi 9,10,11,15,16. Etablerte samkulturmedier er enten DMEM supplert med 10% fosterkalveserum (FCS)9,15 eller vekstfaktorredusert medium10,16. I denne protokollen brukes vekstfaktorredusert medium til å etterligne forholdene i in vivo stamcellenisjen, hvor fibroblaster i stor grad er hvilende. FCS er et vekstfaktorrikt serum som resulterer i aktivering og proliferasjon av fibroblaster i kokulturer, sannsynligvis tilsvarende en fibroblastcelletilstand forskjellig fra in vivo-tilstanden. Ved å ekskludere FCS og redusere vekstfaktorer, slik at mediet alene (ERlavt) ikke støtter organoid vekst og ikke stimulerer fibroblastproliferasjon, er det mulig å isolere effekten av fibroblastene på organoidveksten. I dette mediet fjernes NOGGIN og RSPO reduseres til et minimum (10 % RPSO). Både NOGGIN og RSPO har vist seg å være essensielle for esophageal organoid vekst6. EGF ble beholdt i kokulturmediet, da det ikke støtter organoid vekst av seg selv. Imidlertid er fibroblaster også i stand til å støtte organoid vekst i et EGF-redusert medium (E lavRlav; Figur 2B,D).
Organoide kokulturer kan ikke opprettholdes gjennom passasjing da fibroblaster går tapt under trypsinisering. Imidlertid ble organoid passasje inkludert i protokollen siden esophageal organoider kan opprettholdes, utvides og brukes til videre eksperiment som monokulturer. Passasjerte organoider fra monokulturer kan brukes til å sette opp kokulturer med ferskt isolerte fibroblaster. En ulempe ved å bruke primære celler er antall mus som trengs for å sette opp flere organoide samkulturer. Ved fokus på små subpopulasjoner av fibroblaster er antall oppnådde kokulturer begrenset. I andre protokoller blir fibroblaster først utvidet i kultur før de brukes til å sette opp organoide kokulturer10. Imidlertid endrer fibroblaster morfologi og identitet under passasje, vist ved bruk av primære hud- og hjertefibroblaster17,18. Konvensjonell 2D-passering av esophageal fibroblaster resulterer i både morfologi og fenotypeendringer, noe som viser at in vitro-anrikning av fibroblaster ikke er egnet for kokulturer som tar sikte på fenokopiering av den endogene stamcellenisjen.
Hele mount farging gir et verktøy for å opprettholde og visualisere fibroblast-organoid interaksjon. Det skal bemerkes at selv om ikke alle organoider vil ha fibroblaster direkte festet til dem, er de fleste organoider i kontakt med fibroblaster (se figur 2C). For å opprettholde epithelial-fibroblast-interaksjoner er det viktig å håndtere organoider med forsiktighet og unngå kraftig pipettering, vortexing og høyhastighets spinning. Optimal fiksering er viktig for å opprettholde 3D-vevsarkitektur, samt holde endogen fluorescens. En 30 minutters fiksering er tilstrekkelig for å beholde H2BeGFP-signalet og er optimal for antistoffene som brukes i denne protokollen, men dette kan variere mellom fluoroforene og antistoffene som brukes. Rydding av organoidene reduserer lysspredning og forbedrer visualiseringen av hele 3D-strukturen betydelig. Siden organoidene er små, er rydding enkelt og raskt; Imidlertid kan avbildning av hele organoider ved hjelp av laserskanning konfokalmikroskopi være tidkrevende, da flere Z-stabler må gjøres. Konfokale mikroskoper, som spinnskiven, kan brukes til å redusere bildetiden.
Samlet sett gir esophageal organoider dyrket i nærvær av fibroblaster et verdifullt verktøy for å forstå aspekter av esophageal stemcell nisje. I tillegg gir helmonteringsrydding en tilgjengelig metode for å visualisere samspillet mellom fibroblaster og organoider.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av ERC StG TroyCAN (851241). E.E. er en Cancerfonden Postdoctoral Associate. M.G. er Ragnar Söderberg Fellow og Cancerfonden Junior Investigator. Vi er takknemlige for den tekniske assistansen fra Karolinska Institutets kjernefasiliteter, inkludert Biomedicum Flow Cytometry Core Facility, Biomedicum Imaging Core (BIC) og Comparative Medicine Biomedicum (KMB) dyreavdeling. Vi takker medlemmer av Genander-laboratoriet for nøye å lese og kommentere protokollen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher (Gibco) | 17504001 | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | fisher scientific | 356231 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855-100ML | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher (Gibco) | 11320074 | |
| DPBS | Thermo Fisher (Gibco) | 14190250 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher (Gibco) | 35050061 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermo Fisher (Gibco) | 14175-129 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno | 017-000-121 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher (Gibco) | 15140122 | |
| Triton X-100 solution | Merck | 93443-100ML | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher (Gibco) | 25200-056 | |
| Chemicals, Peptides, and recombinant proteins | |||
| DAPI Solution | Thermo Fisher | 62248 | |
| Dissociation solution: 0.25 mg/ml Liberase TM, 0.25 mg/ml Dnase in HBSS | |||
| Dnase I | Sigma-Aldrich | 11284932001 | |
| Formaldehyde, 37%, with 10-15% methanol | Sigma-Aldrich | 252549-1L | |
| Liberase | Sigma-Aldrich | 5401127001 | |
| N-Acetyl-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-25G | |
| Noggin murine | Peprotech | 250-38 | |
| RapiClear 1.47 | SunJin Lab | #RC147001 | |
| Recombinant Mouse EGF Protein, CF | R&D systems | 2028-EG-200 | |
| R-spondin-1 murine | Peprotech | 315-32 | |
| SYTOX Blue Dead Cell Stain | Thermo Fisher | S34857 | |
| Thermolysin | Sigma-Aldrich | T7902-25MG | |
| Y-27632 dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503-5MG | |
| Plastic & Glassware | |||
| Corning Sterile Cell Strainers 40um | VWR | 15360801 | |
| Corning Sterile Cell Strainers 70um | VWR | 431751 | |
| Menzel Deckgläser/ cover slips | Thermo Fisher | Q10143263NR15 | |
| SafeSeal reaction tube, 1.5 mL, PP | Sarstedt | 72.706 | |
| Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes 0.6 mL | Thermo Fisher | 3446 | |
| SuperFrost Slides | VWR | 631-9483 | |
| Tools | |||
| 0.05 mm 4 circular well iSpacer | SunJin Lab | #IS204 | |
| Dumont #5 forceps, biology tip | F.S.T | 11252-20 | |
| ImmEdge Pen | VectorLaboratories | H-4000 | |
| Spring Scissors Angled to Side Ball Tip 8mm Cutting Edge | F.S.T | 15033-09 | |
| Instruments | |||
| Confocal microscope Stellaris 5 | Leica | ||
| Dissection microscope ZEISS Stemi 305 | Zeiss | ||
| FACS ARIA III | BD Biosciences | ||
| Conjugated Antibodies for FACS | |||
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD104 Antibody Clone: 346-11A |
123608 | 123608 | |
| APC anti-mouse CD26 (DPP-4) Antibody | H194-112 | H194-112 | |
| PE/Cy7 anti-mouse/human CD324 (E-Cadherin) Antibody | 147310 | 147310 | |
| Antibodies for Immunofluorescence | |||
| CD104 (ß-integrin 4) Clone: 346-11A |
BioLegend | 553745 | |
| Cytokeratin 14 | Acris Antibodies (AbD Serotec) | BP5009 | |
| Cytokeratin13 Clone: EPR3671 |
abcam | ab92551 | |
| E-cadherin (CD324) Clone: 2.40E+11 |
Cell Signaling Technology | 3195 | |
| Keratin 5 Polyclonal Chicken Antibody, Purified Clone: Poly9059 |
BioLegend | 905901 | |
| p63 Clone: 4a4 |
abcam | ab735 | |
| Recombinant Anti-KLF4 antibod Clone: EPR20753-25 |
abcam | ab214666 | |
| Vimentin | Sigma-Aldrich | AB5733 | |
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-species* antibodies with fluorophore of choice | Jackson Immuno |
References
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Lohmussaar, K., et al. Patient-derived organoids model cervical tissue dynamics and viral oncogenesis in cervical cancer. Cell Stem Cell. 28 (8), 1380-1396 (2021).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Smukler, S. R., et al. The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin. Cell Stem Cell. 8 (3), 281-293 (2011).
- Zheng, B., et al. A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia. iScience. 24 (12), 103440 (2021).
- DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population. Cell Reports. 9 (2), 701-711 (2014).
- Kasagi, Y., et al. The esophageal organoid system reveals functional interplay between notch and cytokines in reactive epithelial changes. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (3), 333-352 (2018).
- Plikus, M. V., et al. Fibroblasts: Origins, definitions, and functions in health and disease. Cell. 184 (15), 3852-3872 (2021).
- McCarthy, N., et al. Distinct mesenchymal cell populations generate the essential intestinal BMP signaling gradient. Cell Stem Cell. 26 (3), 391-402 (2020).
- Cordero-Espinoza, L., et al. Dynamic cell contacts between periportal mesenchyme and ductal epithelium act as a rheostat for liver cell proliferation. Cell Stem Cell. 28 (11), 1907-1921 (2021).
- Pastula, A., et al. Three-dimensional gastrointestinal organoid culture in combination with nerves or fibroblasts: a method to characterize the gastrointestinal stem cell niche. Stem Cells International. 2016, 3710836 (2016).
- Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
- McGinn, J., et al. A biomechanical switch regulates the transition towards homeostasis in oesophageal epithelium. Nature Cell Biology. 23 (5), 511-525 (2021).
- Zhang, Y., Bailey, D., Yang, P., Kim, E., Que, J. The development and stem cells of the esophagus. Development. 148 (6), (2021).
- Ohlund, D., et al. Distinct populations of inflammatory fibroblasts and myofibroblasts in pancreatic cancer. The Journal of Experimental Medicine. 214 (3), 579-596 (2017).
- Pentinmikko, N., et al. Notum produced by Paneth cells attenuates regeneration of aged intestinal epithelium. Nature. 571 (7765), 398-402 (2019).
- Janson, D., Rietveld, M., Willemze, R., El Ghalbzouri, A. Effects of serially passaged fibroblasts on dermal and epidermal morphogenesis in human skin equivalents. Biogerontology. 14 (2), 131-140 (2013).
- Landry, N. M., Rattan, S. G., Dixon, I. M. C. An improved method of maintaining primary murine cardiac fibroblasts in two-dimensional cell culture. Scientific Reports. 9 (1), 12889 (2019).
