Den streptozotocin-inducerede diabetiske sårmodel hos mandlige SD-rotter er i øjeblikket den mest anvendte model til undersøgelse af sårheling i type I diabetes mellitus. Denne protokol beskriver de metoder, der bruges til at konstruere denne model. Det præsenterer og adresserer også potentielle udfordringer og undersøger progression og angiogene egenskaber ved diabetiske sår.
En enkelt høj dosis streptozotocin injektion efterfulgt af fuld tykkelse hud excision på dorsum af rotter er en almindelig metode til konstruktion af dyremodeller af type 1 diabetiske sår. Imidlertid kan forkert manipulation føre til model ustabilitet og høj dødelighed hos rotter. Desværre er der få eksisterende retningslinjer for type 1 diabetisk sårmodellering, og de mangler detaljer og præsenterer ikke specifikke referencestrategier. Derfor beskriver denne protokol den komplette procedure til konstruktion af en type 1 diabetisk sårmodel og analyserer progression og angiogene egenskaber ved diabetiske sår. Type 1 diabetisk sårmodellering involverer følgende trin: forberedelse af streptozotocininjektionen, induktion af type 1-diabetes mellitus og konstruktion af sårmodellen. Sårområdet blev målt på dag 7 og dag 14 efter sår, og rotternes hudvæv blev ekstraheret til histopatologisk og immunfluorescensanalyse. Resultaterne viste, at type 1 diabetes mellitus induceret af 55 mg / kg streptozotocin var forbundet med lavere dødelighed og en høj succesrate. Blodsukkerniveauet var relativt stabilt efter 5 ugers induktion. Den diabetiske sårhelingsrate var signifikant lavere end for normale sår på dag 7 og dag 14 (p < 0,05), men begge kunne nå mere end 90% på dag 14. Sammenlignet med den normale gruppe var epidermallagets lukning af diabetiske sår på dag 14 ufuldstændig og havde forsinket re-epithelialisering og signifikant lavere angiogenese (p < 0,01). Type 1 diabetisk sårmodel konstrueret baseret på denne protokol har karakteristika for kronisk sårheling, herunder dårlig lukning, forsinket re-epithelialisering og nedsat angiogenese sammenlignet med normale rottesår.
Type 1 diabetes mellitus (T1DM) er en kronisk metabolisk sygdom præget af hyperglykæmi og ødelæggelse af β-celler i bugspytkirtlen1. Et T1DM-sår er et kronisk ikke-helende sår og den mest almindelige og ødelæggende komplikation til diabetes hos mennesker 2,3. Dyremodeller er de mest hensigtsmæssige prototyper til undersøgelse af patologiske forandringer under sårheling og sikkerheden og effektiviteten af potentielle terapeutiske midler4. Sammenlignet med andre typer er hanrotter af Sprague-Dawley (SD) mere følsomme over for streptozotocin (STZ) og viser en lavere relateret dødelighed, hvilket gør dem populære i diabetisk sårforskning 5,6.
Talrige metoder til konstruktion af T1DM sårmodeller er blevet beskrevet. Med hensyn til T1DM-modellen har undersøgelser primært fokuseret på effekten af STZ-injektionsmetoden på succesraten for diabetesinduktion 7,8. Modelleringsprocessen lider imidlertid af den inkonsekvente drift af det samme trin. I en undersøgelse fastede rotter i 18 timer før STZ-injektionen; rotter med blodsukkerniveauer højere end 16,67 mmol/l 1 uge efter STZ-injektionen blev anset for diabetiker, og diabetikersåret blev indført efter 3 uger9. Omvendt fastede Zhu et al. i en relateret undersøgelse rotter i 12 timer før STZ-injektionen; rotter med blodsukkerniveauer højere end 16,7 mmol / l 72 timer efter injektionen blev betragtet som diabetiker, og diabetisk sår blev introduceret efter 4 uger10. Samlet set er der uoverensstemmelser i STZ-injektionsprotokollerne, diabetesdiagnosekriterier og sårintroduktionstider.
Med hensyn til sårmodellering udskæres den fulde tykkelse af dorsalhuden i de fleste undersøgelser for at konstruere T1DM-sår efter vellykket diabetesinduktion11,12,13. Selvom denne model er modtagelig for hudkontraktur hos rotter, er det den mest almindeligt anvendte model i sårhelingsforskning, fordi den er mindre arbejdskrævende og er billig14,15. Ikke desto mindre mangler metodestyret forskning i denne excisionsteknik i fuld tykkelse. Desuden er der ingen ensartede standarder i eksisterende undersøgelser vedrørende sårstørrelse og placering12,16. Sårets størrelse og placering kan indirekte påvirke konsistensen af det eksperimentelle design og resultaternes videnskabelige validitet. Derfor er der et presserende behov for en standardprotokol for T1DM induktion og sårmodellering som reference for forskere. Målet med denne undersøgelse er at visualisere en specifik protokol til T1DM sårmodellering, der kan bruges som reference for T1DM sårundersøgelser.
Denne protokol præciserer de omstridte operationer i T1DM sårmodellering. Bekymringer om STZ-injektionsprotokollerne, T1DM-induktionssucceskriterier, blodsukkerstabiliseringstid og sårplacering og størrelse er blevet behandlet i dette arbejde. Desuden er de patologiske egenskaber og målbare parametre for T1DM sårhelingsvurdering blevet præciseret.
Rotterne fastede i 18 timer før STZ-injektionen for at undgå konkurrencedygtig binding af glukose eller dets analoger til β-celler, hvilket kunne påvirke effekten af STZ. Den mest almindeligt anvendte metode til at inducere T1DM er en enkelt høj dosis STZ, som øger blodsukkeret ved at beskadige øerne og nedsætte insulinsekretionen21. Pre-eksperimentelle forsøg viste, at den optimale STZ dosis for en høj succesrate og en lav dødelighed var 55 mg / kg, hvilket er lavere end de optimale doser rapporteret i tidligere undersøgelser22,23,24. I denne protokol blev T1DM induceret under anvendelse af en enkelt intraperitoneal injektion på 55 mg/kg STZ.
Blodsukkerniveauet var alle højere end 16,7 mmol/l 3 dage efter STZ-injektionen. Imidlertid er et blodsukkerniveau højere end 16,7 mmol / L på dag 7 efter STZ-injektion det anbefalede kriterium for vellykket T1DM-modellering, fordi omfanget af øskader varierer blandt rotter, og en passende forlængelse af diagnosetiden kan reducere den falsk-negative hastighed. Derudover stabiliserede blodsukkersvingningerne sig 5 uger efter STZ-injektionen, og rotterne tog gradvist på i vægt i denne periode, i overensstemmelse med tidligere fund25,26. Dette indikerer, at blodsukkerniveauet i T1DM-modellen skal stabiliseres i mindst 6 uger, og en stigning i rottevægt efter 6 uger reducerer dødeligheden under sårmodelleringen. Derfor udførte denne protokol sårmodellering 8 uger efter STZ-injektionen.
Sårlukningshastigheden på dag 7 og dag 14 efter såret var signifikant lavere hos diabetikeren end i den normale sårgruppe, hvilket indikerer langsom heling. Desuden var sårepithelialisering og angiogenese signifikant lavere hos diabetikeren end i den normale gruppe. Dette viser, at T1DM-sårmodellen viser langsommere sårheling og forsinket re-epithelialisering end hos normale rotter, hvilket kan være relateret til de patologiske ændringer af reduceret sårangiogenese. På dag 14 var T1DM-sårhelingshastigheden imidlertid også over 90%, hvilket adskiller sig fra den kroniske ikke-helende egenskab ved humane diabetiske sår. Dette kan skyldes, at gnaveres fysiologiske mekanismer til sårheling adskiller sig fra menneskers27. Derfor er den bedste sårdiameter mindst 20 mm, hvilket er stort nok til at give tid til at vurdere en interventions effektivitet i et diabetisk sårstudie. Sårplaceringen bør undgå skulderblad og rygsøjle, da kontinuerlig bevægelse på disse to steder kan forstyrre sårheling.
Afslutningsvis er konstruktionen af T1DM-sårmodellen ved hjælp af metoden i denne protokol effektiv. Protokollen replikerer nogle af egenskaberne ved kroniske diabetiske sår, såsom langsommere sårheling, forsinket re-epithelialisering og reduceret angiogenese sammenlignet med normale rottesår. Det vides dog ikke, om modellen kan replikere andre kroniske fænotyper af diabetiske sår. Desuden beskriver denne protokol den mest grundlæggende og udbredte metode, som ikke tager højde for spørgsmålet om hudkontraktion hos rotter. Fremtidig forskning kan inkorporere brugen af sårskinner i denne protokol eller udforske yderligere modeller af kroniske diabetiske sår, hvilket vil være en betydelig udfordring for forskere i fremtiden.
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev støttet økonomisk af National Natural Science Foundation of China (82104877).
Antifade mounting medium | Southern Biotechnology Associates, Inc. | 0100-01 | |
AutoFluo Quencher | Servicebio Technology co., Ltd. | G1221 | |
Automatic slide stainer | Thermo Fisher Scientific Inc. | Varistain™ Gemini ES | |
CD31 | Servicebio Technology co., Ltd. | GB11063-2 | |
Citrate antigen retrieval solution | Servicebio Technology co., Ltd. | G1201 | |
Cover glass | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd. | 10212432C | |
DAPI | Servicebio Technology co., Ltd. | G1012 | |
Decolorization shaker | Scilogex | S1010E | |
Depilatory cream | Guangzhou Ruixin Biotechnology Co., Ltd. | — | |
Dimethyl benzene | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd. | 64-17-5 | |
Drug oscillator | Shenzhen Jiashi Technology Co., Ltd. | VM-370 | |
Electric razor | Shanghai Flyco Electrical Appliance Co., Ltd. | FC5908 | |
Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd. | JB-P5 | |
Ethanol absolute | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd. | 1330-20-7 | |
Fitc-labeled goat anti-rabbit IgG | Servicebio Technology co., Ltd. | GB22303 | |
Goat serum | Thermo Fisher Scientific Inc. | 16210064 | |
Hematoxylin and eosin staining solution | Beijing Regan Biotechnology Co., Ltd. | DH0020 | |
Image J software | National Institutes of Health | — | |
Microwave oven | Midea Group Co., Ltd. | M1-L213B | |
Mini centrifuge | Scilogex | D1008 | |
Neutral balsam | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
Portable blood glucose meter | Sinocare Inc. | GA-3 | |
Rapid tissue processor | Thermo Fisher Scientific Inc. | STP420 ES | |
Rat fixator | Globalebio (Beijing) Technology co., Ltd | GEGD-Q10G1 | |
Slicing machine | Thermo Fisher Scientific Inc. | HM325 | |
Slides glass | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd. | 80312-3181 | |
sodium citrate buffer | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | c1013 | |
Streptozotocin | Sigma | 57654595 |