Padronização da Transferência entre Laboratórios entre Citômetros de Fluxo para Detecção de Linfócitos em Crianças Vacinadas com Encefalite Japonesa

Summary

Neste estudo, foi desenvolvido um método para facilitar a transferência de cenários experimentais e modelos de análise entre dois citômetros de fluxo em dois laboratórios para a detecção de linfócitos em crianças vacinadas com encefalite japonesa. O método de padronização para os experimentos de citômetro de fluxo permitirá que os projetos de pesquisa sejam efetivamente conduzidos em vários centros.

Abstract

Um número crescente de laboratórios precisa coletar dados de vários citômetros de fluxo, especialmente para projetos de pesquisa realizados em vários centros. Os desafios do uso de dois citômetros de fluxo em laboratórios diferentes incluem a falta de materiais padronizados, problemas de compatibilidade de software, inconsistências na configuração do instrumento e o uso de diferentes configurações para diferentes citômetros de fluxo. Para estabelecer um experimento padronizado de citometria de fluxo para alcançar a consistência e a comparabilidade dos resultados experimentais em vários centros, um método de padronização rápido e viável foi estabelecido para transferir parâmetros entre diferentes citômetros de fluxo.

Os métodos desenvolvidos neste estudo permitiram a transferência de cenários experimentais e modelos de análise entre dois citômetros de fluxo em diferentes laboratórios para a detecção de linfócitos em crianças vacinadas com encefalite japonesa (JE). Uma intensidade de fluorescência consistente foi obtida entre os dois citômetros usando esferas padrão de fluorescência para estabelecer as configurações do citômetro. Resultados comparáveis foram obtidos em dois laboratórios com diferentes tipos de instrumentos. Usando este método, podemos padronizar a análise para avaliar a função imunológica de crianças vacinadas com JE em diferentes laboratórios com diferentes instrumentos, diminuir as diferenças de dados e resultados entre citômetros de fluxo em múltiplos centros e fornecer uma abordagem viável para a acreditação mútua de resultados laboratoriais. O método de padronização de experimentos de citômetros de fluxo garantirá o desempenho efetivo de projetos de pesquisa em vários centros.

Introduction

A padronização da citometria de fluxo é útil para a comparabilidade dos resultados obtidos de diferentes citômetros em diferentes laboratórios e centros de estudo, e conducente ao reconhecimento mútuo dos resultados para melhorar a eficiência do trabalho. Um número crescente de cenários requer padronização. Durante o processo de desenvolvimento do medicamento, a padronização da citometria de fluxo é importante, pois um ensaio desenvolvido e validado apoiará todo o processo de desenvolvimento do medicamento, desde a análise pré-clínica até a clínica. Os métodos citométricos de fluxo são frequentemente transferidos entre a indústria farmacêutica e os laboratórios colaboradores¹. Além disso, é essencial obter dados comparáveis de estudos clínicos multicêntricos. Por exemplo, um fluxo de trabalho de padronização foi desenvolvido no Systemic Autoimmune Diseases Multicenter Clinical Research Project para obter dados comparáveis da citometria de fluxo multicêntrica².

A padronização dos métodos de citometria de fluxo é um desafio. Os desafios vivenciados entre os laboratórios são atribuídos à falta de materiais padronizados, problemas de compatibilidade de software, inconsistências na configuração do instrumento e ao uso de diferentes configurações entre diferentes citômetros de fluxo e estratégias de gating divergentes entre os centros ^3,4. Portanto, é importante realizar uma análise de lacunas entre os laboratórios. O acesso a amostras, os sistemas de qualidade, as qualificações de pessoal e a configuração do instrumento devem ser revisados para garantir que os requisitos sejam atendidos.

Atualmente, as crianças vacinadas com a vacina contra encefalite japonesa (JE) têm uma incidência significativamente reduzida de JE⁵. O monitoramento das células imunes do sangue periférico pode ajudar a entender as mudanças na imunidade adaptativa mediada por células após a vacinação e a correlação entre as mudanças nos subconjuntos de linfócitos do sangue periférico e os efeitos da vacinação. Devido à estabilidade limitada das amostras de sangue total, as avaliações da eficácia da vacina são frequentemente realizadas em vários centros. Para esta análise, definimos células T CD8+ ou CD4+ ingênuas como CD27+ CD45RA+, células T de memória central (T_CM) como CD27+ CD45RA-, células T de memória efetora (T_EM) como CD27- CD45RA-, e células T de memória efetora terminalmente diferenciadas (T_EMRA) como CD27^– CD45RA⁺. As células B CD19⁺ podem ser separadas em populações que expressam CD27 versus IgD ^6,7, as células B ingênuas expressam células B de memória CD27n (mBCs) podem ser identificadas com base na expressão de IgD⁶ e as células T reguladoras (Tregs) podem ser identificadas como CD4⁺CD25⁺⁺CD127^{baixa 8}. Para estabelecer um experimento padronizado de citometria de fluxo para alcançar a consistência e comparabilidade dos resultados experimentais em múltiplos centros, um método de padronização rápido e viável foi estabelecido para facilitar a transferência de protocolos entre diferentes citômetros de fluxo para a detecção de linfócitos no sangue total de crianças vacinadas com JE. Seis crianças saudáveis (2 anos de idade) foram recrutadas do Hospital Infantil de Pequim, Capital Medical University. Depois de receber uma vacinação prime e boost com uma vacina JE SA14-14-2 atenuada ao vivo menos de 6 meses antes, amostras de sangue periférico foram coletadas dos voluntários. Dados altamente comparáveis foram obtidos de diferentes instrumentos seguindo procedimentos padronizados, o que é útil para avaliações multicêntricas.

Protocol

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Infantil de Pequim, Capital Medical University (Número de Aprovação: 2020-k-85). O consentimento informado de seres humanos foi dispensado, pois apenas amostras residuais após testes clínicos foram utilizadas neste estudo. Dois laboratórios estão envolvidos neste estudo. O laboratório de transferência é onde o método padronizado foi desenvolvido usando um citômetro de fluxo. O citômetro neste laboratório é doravante referido como <st…

Representative Results

A Figura 1 mostra uma planilha global do modelo de valor de destino para as contas brilhantes CST. Usando um gráfico FSC/SSC, uma porta de polígono é desenhada para selecionar as contas brilhantes CST. Gráficos de histograma de 10 canais de fluorescência foram obtidos para as esferas brilhantes de STC: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 e BV605. O valor de destino para cada parâmetro é exibido mostrando a mediana dentro das portas do histograma na Tabela 2…

Discussion

A imunofenotipagem de subconjuntos de linfócitos do sangue periférico pode ajudar a entender as mudanças na imunidade adaptativa mediada por células após a vacinação em crianças. Em aplicações clínicas, ocorrem situações inesperadas, como a falha em detectar amostras em tempo hábil ou a substituição de um citômetro de fluxo; portanto, são necessários métodos padronizados rápidos que facilitem as transferências entre citômetros de fluxo em diferentes laboratórios9,10,11.<sup…

Materials

BD CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD	552843	compensation
BD FACSCanto	BD	FACSCanto	flow Cytometry A in the transferring lab
BD FACSDiva CS&T Research Beads	BD	655051	define flow cytometer baseline and track cytometer performance
BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127	BD	562436	Fluorescent antibody
BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27	BD	562656	Fluorescent antibody
BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45	BD	560777	Fluorescent antibody
BD LSRFortessa	BD	LSRFortessa	flow Cytometry B in the test method lab
BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19	BD	745907	Fluorescent antibody
BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8	BD	751953	Fluorescent antibody
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA	BD	550855	Fluorescent antibody
BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3	BD	560176	Fluorescent antibody
BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4	BD	566320	Fluorescent antibody
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25	BD	555432	Fluorescent antibody
BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD	BD	561314	Fluorescent antibody
Brilliant Staining Buffer Plus	BD	566385	Staining Buffer
Centrifuge	Eppendorf	5810	Cell centrifugation
Centrifuge Tube	BD Falcon	BD-35209715	15 mL centrifuge tube
CS&T IVD Beads	BD	662414	standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer
Lysing Solution 10x Concentrate	BD	349202	lysing red blood cells
Phosphate-buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-023	PBS
Round-bottom test tube	BD Falcon	352235	5 mL test tube