收集自发的大鼠行为数据以表征中风后缺陷

Summary

提出了一种系统，用于从社会群体笼环境中自发的个体行为会话中获取数据。该系统的功效通过自动化熟练伸展评估得到证明，可以表征中风后运动障碍、与动机相关的潜在行为改变、昼夜节律变化和其他创新的因变量。

Abstract

大鼠模型中的行为测试经常用于多种目的，包括心理、生物医学和行为研究。许多传统方法涉及在实验中单个研究人员和每只动物之间进行单独的、一对一的测试会话。对于研究人员来说，这种设置可能非常耗时，并且它们的存在可能会以不需要的方式影响行为数据。此外，用于大鼠研究的传统笼子缺乏通常对该物种来说典型的富集、锻炼和社会化，这种情况也可能扭曲行为数据的结果。克服这些限制对于一些研究应用可能是值得的，包括获得性脑损伤的研究。在这里，提出了一种示例方法，用于在没有人类在场的情况下自动训练和测试蜂群笼中的个体大鼠行为。射频识别可用于为个体大鼠定制疗程。该系统的验证是在测量中风前后熟练前肢运动性能的示例环境中进行的。测量了中风后行为障碍的传统特征和系统启用的新措施，包括成功率、拉力的各个方面、回合分析、启动率和模式、会话持续时间和昼夜节律模式。这些变量可以自动收集，几乎没有限制;尽管该装置取消了对暴露、时间和实践的实验控制，但验证在动物与动物之间的这些变量中产生了合理的一致性。

Introduction

使用大鼠模型进行行为训练和测试在无数研究领域中都很重要，从认知过程的探索到疾病状态等等¹.通常，这种训练和测试是在一对一的课程中对单个动物进行的，研究人员手动将动物从笼子中取出，并暂时将它们放置在某种设备中。不幸的是，这种方法存在一些困难和局限性。首先，行为测试对研究人员来说可能需要花费大量时间，而当需要培训时，时间要求就变得更大了。其次，这种方法会自动影响甚至可能混淆所获取的数据，正如在其他地方所确定的那样².在考虑富集相关变量时，这些混杂因素尤为突出。具体来说，实验室大鼠传统上被饲养在小笼子里，这些笼子只够容纳一到两只老鼠³，如果没有提供跑轮，它们可能会一辈子没有有意义的锻炼机会。此外，孤立的住房可能是大鼠等社会物种的主要压力来源⁴.其中一些与福利相关的缺点可能会影响大鼠的生理学 ^5,6，^这可能会抢占物种典型行为表达的发展⁴ 并影响应用于人类环境的啮齿动物模型的质量。

近年来，研究人员一直在寻求几种类型的解决方案来解决这些问题。最简单的解决方案是自动化行为测试和训练7,8,9,10，从而消除了单个研究人员关注单个动物的要求。另一个解决方案是将动物自动转移到实验室^11,12，^进一步消除了对人类参与的需要。最后，已经探索了几种设置，这些设置允许动物与其他动物一起被安置在笼子里，并有更多的探索和丰富空间¹³.尽管有这些优点，但这种菌落设置可能会限制或复杂化收集个体差异化行为数据的努力（尽管请参阅使用计算机视觉的努力）^14,15。如果需要个体行为数据，那么从群体笼养中识别和检索动物以进行行为会话也可能更加困难或复杂。目前，很少有系统用于从（富集）殖民地收集个体行为数据 ^16,17,18。

这些缺点可能会特别影响对获得性脑损伤行为影响的研究。首先，很明显，人类的存在和/或性别以及处理方式会影响啮齿动物的行为 ^2,19，这些变量可能会对大鼠之前的行为产生不同的影响。中风后。其次，中风后的人类行为结果可能会因自愿减少对推荐剂量的康复锻炼的参与而恶化²⁰.目前，啮齿动物实验往往不会对这种环境进行建模，因为老鼠不能自由选择参与或放弃行为会话。

本文介绍了一种协议，旨在促进在富集菌落笼框架内的个体行为测试。这种做法不仅解决了当前做法的制约因素，而且为探索创新措施开辟了途径。已经开发出一种单鼠旋转门（ORT），可以将其固定在蜂群笼子上，使动物能够独立进入行为室并开始自己的训练和测试课程。该系统价格实惠;每个ORT都可以以低成本组装（可以使用3D打印机）。过去，该系统的验证是使用基本的操作室进行的，表明可以在没有实验者在场的情况下持续训练动物执行简单的操作杠杆按压¹⁶。然而，这种配置是否适用于其他方案的问题仍未解决。目的是验证先前建立的 ORT 殖民地笼子设置的有效性，用于训练和量化与中风后运动障碍相关的熟练伸展行为。该配置用于生成中风研究中通常不会探索的新变量。这些变量包括熟练达到任务的绩效指标和自我启动的测量，这可能与动机和决策有关。此外，中风诱导的在整个 24 小时内每日自我启动的昼夜节律模式的变化被有效检测。

Protocol

所有程序和动物护理均已获得北德克萨斯大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准，并遵守美国国立卫生研究院关于实验动物护理和使用指南。本研究中使用的成年雄性和雌性Long-Evans大鼠（400-800g，1.5岁）被饲养在菌落笼中。

1、设备准备

1. 根据设计文件和施工说明获取或组装独鼠闸机 （ORT）（见 补充文件1 和 补充编码文件1）。有关详细信息，请参阅 Butcher 等人 ¹⁶ 。
   注意：ORTs特定于大鼠的大小，因此菌落笼应包括大小大致相同的动物。如果不想自行组装 ORT，可以购买预组装的 ORT（参见 材料表）。
2. 获取并连接射频识别（RFID，见 材料表）阅读器，并获取并注射带有 RFID 标签的动物。
   注意： 注入 RFID 全双工 （FDX） 标签时，当大鼠穿过 ORT 时，方向必须垂直于 RFID 天线。在该验证中，标签被皮下植入肩胛骨之间，位于与脊柱平行的平面上。
3. 将 RFID 天线固定在 ORT 的管子上。
4. 构建和/或获得适合实验问题的行为装置和菌落笼。在这个例子中，定制的菌落笼^21,22 与市售的操作室（见材料表）结合使用，尽管理论上可以使用任何设备。
   注意：应考虑通过ORT访问行为设备的群居动物竞争。 预计每 4 到 6 只动物需要一个 ORT + 行为设备。
5. 将 ORT 连接到行为装置和菌落笼之间。
6. 使用Dremel旋转工具（参见 材料表）或类似仪器在行为装置和菌落笼中切割一个门户孔。内径应等于所建ORT隧道的外径。
   注意：ORT 必须升高几英寸才能运行，因此需要一个小平台或支架来对齐菌落笼和设备高度。
7. 安装 RFID 系统以在动物通过 ORT 时读取它们，并在需要时将其与行为设备集成。

2. 术前行为训练

1. 获得相同大小的大鼠队列并将它们引入菌落笼中。
   注意：在隔离中广泛饲养或饲养的动物或很少有同种动物在探索房间时可能会遇到更多困难，尤其是当它涉及穿越群体笼子的社会区域时。动物应该在生命早期就暴露在群体笼中，以避免这种陷阱。
2. 移除对行为设备内任何操纵者的访问权限，并将房间设置为在被占用时平均每 60 秒自动提供奖励。
   注意：这项研究使用蔗糖水（30%至40%）作为奖励，但加糖的炼乳也是有效的。
3. 训练所有大鼠定期 通过 ORT进入行为装置。
4. 每天至少检查一次数据，以确保所有动物都进入ORT。如果动物没有进入，将笔大小的物体插入锁定机构，以防止其暂时锁定，让动物更自由地探索。如果动物仍然没有进入，请拆除旋转门并连接一个临时侧壁，以允许自由隧道进入房间。
5. 一旦所有动物都定期进入房间，归还锁（和旋转门）并重新评估。
   注意：动物也可以占据ORT和腔室，作为对其他老鼠的暂时缓解。防止这种对腔室垄断的一种方法是连接一个额外的ORT，该ORT桥接到一个简单的隔离室。
6. 引入机械手（在本例中为拉手）并设置为最高灵敏度。将手柄插入盒子内部（最多 2 厘米）或盒子外。
   注意： 如果将 Painter 的胶带贴在手柄的背面，则可能会引起伸手尝试，刚好够不到。
7. 减少奖励（即 30% 蔗糖水）自动输送的频率（例如，每 90-120 秒一次）。请记住，任何奖励都可以用于满足实验者的需求和动物的偏好。
8. 每天检查数据，确保所有动物都学会了激活杠杆。诱饵控制杆和/或改变插入水平，直到所有动物都拉动。
9. 停止自动交付奖励，以便它们只能通过激活拉动手柄 来 使用。
10. 如果先前插入，则每天将杠杆缩回0.25毫米至0.5毫米（前提是所有大鼠继续在该缩回水平拉动），直到杠杆处于其最终位置，在腔室外1厘米至1.25厘米处。
    注意：控制杆的确切位置取决于大鼠的大小。确保选择一个位置，导致所需的到达地形。
11. 启动百分位数或其他训练计划，以逐渐增加激活手柄所需的拉力。
    注意：本研究使用百分位数计划，将强化标准设置在前 15 个响应的上四分位数。或者，可以使用拉力准则的逐步增加^7。
12. 一旦动物可靠地达到 120 g 拉力的最终标准范围，就删除百分位数训练程序并将手柄激活的标准固定在 120 g 的常数。
13. 在此力要求下收集基线数据，直到成功率稳定（非趋势）大约一周。

3.诱发中风

1. 手术同时在所有群体笼养动物中诱发中风。
   注：为了诱发中风，使用了内皮-1 中风模型，该模型已在其他地方描述过²³。
2. 让动物在传统的笼子里恢复，单独隔离 3-7 天。

4. 术后行为测试

1. 恢复后，使用 ORT 连接的熟练伸展装置将动物送回殖民地笼养。
2. 进行行为测试，将拉力要求保持在 120 g 的最终值（遵循第 2 步），直到收集到足够的数据来评估中风后缺陷（一到几天）。
3. 在随后的几天里，当动物进入腔室时，实施任何与中风后或恢复相关的自变量。

Representative Results

这些动物在一个菌落笼中用四只雌性大鼠和在另一个菌落笼中的四只雄性大鼠进行训练和测试。所有大鼠都在四天或更短的时间内学会了通过ORTs。在大约 6 周的训练中，四只雌性大鼠在 120 g 力要求下达到了 >85% 的成功率，雄性大鼠在 10 周内达到了相同的标准（相比之下，与剥夺大鼠的标准训练相比大约 3 周）⁷。由于在第 2 周到第 6 周之间出现多个硬件和软件故障，需要持续进行故障排除，因此此培训持续时间大大延长。一旦这些故障得到解决，培训就顺利进行，预计后续的培训时间表将与目前的文献相当⁷.雄性大鼠也接受了更长的训练，以便为一只雄性大鼠提供更多开始拉扯的机会;然而，他从未这样做过，并且在第 7 周后被排除在进一步的分析和手术之外。一旦大鼠性能在基线上稳定，就获得每个笼子的 5 天中风前基线数据。数据仅限于ORT一整天都与网箱保持连接的天数（有些日子需要与畜牧业相关的临时断开连接）。对于雌性笼子，基线天数为卒中前 7、8、9、10 和 12 天。对于男性，基线天数为卒中前 8、9、10、11 和 13 天。

在他们的中风诱导手术中，该验证中的动物同时在其基底前脑（坐标 -5.8 毫米前/后，0.7 毫米左内侧/外侧，8.3 毫米背/腹）或腹侧被盖区（坐标 -2.3 毫米前/后，3.3 毫米左内侧/外侧，7.0 毫米背/腹）。这些植入物用于随后的恢复实验，与此处报告的菌落笼-ORT 验证无关。植入物的设计使得皮肤可以闭合在它们上面，接收芯片位于左臂下方的皮下。

一只雌性动物在中风诱导期间死亡。另一名女性在康复几天后开始下降，中风后从未拉过手柄。在她被安乐死后，人们发现她可能在中风后的某个时候经历了脑出血。这两只动物被完全从数据集中排除，包括中风前评估。

中风后，动物不会立即重新开始常规的杠杆拉动，尽管它们继续 通过 ORT进入腔室，并且必须通过短暂的手动塑形来鼓励它们（即，减少杠杆距离并在接近或试图拉动杠杆时提供奖励）。雌性大鼠在中风后第4-7天没有拉动，因此在第8-11天给予补充杠杆诱饵（即，在杠杆上少许花生酱）和手动塑形。他们在第 11 天开始自主拉动。根据以前与雌性的经验，雄性被允许恢复到第 6 天。他们在中风后第 6 天没有拉伤。他们在第 7 天接受了补充诱饵。他们在中风后的^第 8 天开始自主拉扯。一旦动物再次接触加固物进行拉扯尝试，就停止补充诱饵或塑形，并收集中风后的数据。男性在第 8 天没有拉足足够的拉力来完成对更复杂的因变量（昼夜节律测量和赛后停顿）的分析，因此他们被允许在第 9^天、第 10^天和第 11^天以 相同的标准继续拉动。第 8^天、第 10^天和第 11^天是 完整的日子。除昼夜节律分析和回合之间的停顿分析外，所有分析均使用中风后拉伤的第一天;在此分析中，使用了女性的一天和男性的整整三天。对于中风后分析，两只雌性大鼠在一天内提供了55次和844次拉动，三只雄性大鼠在三天内提供了536次、153次和190次拉动。

数据根据拉扯和回合进行组织。为了避免记录由设备本身引起的震动，使用 5 g 阈值和 +/- 1 g 滞后来测量拉力。当动物施加高于 6 g 的压力时，会记录到拉力，当手柄施加的力低于 4 g 时，拉力会停止。动物倾向于进行几次快速拉扯。一旦任何单次拉力达到 120 g，就会进行加固。一场比赛被认为是一组拉力，其峰值之间的间隔都小于 1 秒。该阈值是根据前人数据选择的，表明1 s以下的峰间区间簇自然形成，其他峰间区间簇可靠地要长得多。老鼠通常会在访问喂食器之前连续多次拉动，即使早些时候的拉动激活了喂食器。

共分析了7个因变量。在基线平均值和卒中后测量值之间进行了配对 t 检验 ， 如图 1、 图 2 和 图 3 所示。这些数字还显示了个体动物的数据，以提供可能预期的每种措施在几天之间以及个体之间变化的印象。

图 1 显示了中风前和中风后的表现，以及熟练伸展评估的几种典型表现指标 ^7,8,10。所有卒中后数据都汇总到一个数据点中，即使需要几天时间才能收集到足够的试验。该协议和自动自启动系统成功评估了每场比赛的成功率、每次拉球的平均力和每场比赛的拉力，这些都显示出对击球的敏感性，并具有不同程度的统计显着性。

图 2 描绘了由菌落笼-ORT 设置产生的两个新变量：会话启动和累积会话持续时间。令人惊讶的是，中风并没有影响疗程的启动。在中风前后，女性比男性更可靠地开始治疗，但中风后的速率都没有改变。相反，对于大多数大鼠来说，在腔室中花费的时间增加了，这可能是由于回合成功率降低（其结果是奖励率降低）

会议开始（代表在殖民地笼子中可用的致富和社会奖励与食物强化之间的选择）和在房间中的时间持续时间（在有条件的地方偏好和奖励值的情况下）也可以作为动机的指标24,25,26,27。还包括其他基于动机的衡量标准，例如“努力”，通过每节课²⁸ 分钟的拉动和回合之间的停顿²⁹ 来量化，如图 3 所示。这些变量受到中风的影响。正如预期的那样，每分钟拉动的次数减少了，回合之间的停顿持续时间增加了。然而，后一种措施的变化是复杂的。回合停顿的分布似乎变得更加混乱，包括更长的停顿、一些非常长的停顿以及更短的停顿。这可能表明原始熟练的运动单元出现故障;如果是这样，它可能是一个易于衡量的指标。

尽管小组规模很小，但进行了一项调查，以确定是否有任何测量变量与成功率表现出相关性，这可能暗示它们具有功能意义。执行 Shapiro Wilk 检验以评估变量成功率、平均峰值拉动、每分钟回合、累积会话持续时间、回合之间的停顿和每次回合的拉动的数据均匀分布。Shapiro Wilk 检验表明，一些变量的分布明显偏离了正态性。因此，执行 Spearman 的秩顺序相关性来确定中风前或中风后成功率与以下变量之间的关系：平均峰值、每分钟拉杆次数、累积会话持续时间、回合之间的停顿和每次回合的拉杆次数。除了平均拉力外，中风前的变量与成功率没有显著相关性（见 表1）。中风后，除了平均拉力外，大多数变量与成功率也没有有意义的相关性（表1）。

最后，ORT不仅可以分析熟练的运动行为，还可以分析昼夜节律模式。图 4 显示了每个笼子中 ORT 占用的每小时比例，以基线和卒中后天数的平均值表示。图中的蓝线表示一天中每小时输入数的平均计数。在中风之前，动物会在早上进行高水平的熟练伸展任务，从而减少它们一整天的持续时间。在开灯前几个小时，参与度要么再次飙升（女性），要么略有增加（男性），然后在灯亮后不久停止。这种双峰昼夜节律分布在中风后完全改变。动物在早晨的参与较少，它们在房间里的时间在当天晚些时候达到顶峰。这种模式可能反映了中风后经常观察到的一般睡眠和昼夜节律紊乱 30,31,32,33。

图 1：使用 ORT 程序测量中风后熟练伸展的典型性能变化。 测量了中风前后熟练伸展的表现。在基线后 5 天和中风后 1 天（左）以及基线平均值和中风后 1 天（中风后）之间，按动物划分的每次回合成功率、每次拉力和每次回合拉力的日平均值，并报告配对 t 检验。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 2：不同的自启动会话参数在卒中后显示出不同的变化趋势。 ORT 程序使中风前后熟练的伸展行为课程的自我启动措施成为可能。在基线 5 天和中风后 1 天（左）以及基线平均值和中风后 1 天（中风后）之间，按动物划分的会话开始和累积每日会话持续时间的日平均值显示在报告的配对 t 检验中。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 3：中风后与动机相关的变量会发生变化。 确定了与动机相关的中风前后熟练达到行为会话的绩效测量。在基线 5 天和中风后 1 天（左）以及基线平均值和中风后 1 天（中风后）之间（中风后）期间，动物在回合之间暂停持续时间的日平均值和每次会话分钟的每日回合率，并报告了配对 t 检验。就这些日平均值而言，回合之间的停顿发生了变化，但更引人注目的是，中风后个体停顿长度的分布在平均值的两侧也发生了变化。所有动物的单个暂停长度被合并，并在对数轴（最右边）上显示为分布。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 4：中风后自行启动会话的昼夜节律模式发生变化。 确定了所有动物、雌性和雄性在中风前（左）和后（右）自发的熟练伸展行为会话的昼夜节律模式测量。这些数据包括所有进入和笼子占用腔室的所有时间，在卒中前和卒中后的日子里取平均值。然后再次对两个笼子进行平均，以显示总分布（顶行）。中风前的模式包括早晨的高度参与，在整个清醒期间这种参与度逐渐减少，在睡眠阶段之前出现新的高峰。卒中后模式显示疗程持续时间在白天增加，并在睡眠阶段之前达到峰值。老鼠在他们的宿舍里进行反向光循环。开灯时间以灰色阴影显示，表示大鼠的正常不活动期。 请点击这里查看此图的较大版本.

相关性
变量	比较变量	斯皮尔曼
		n	中风前 rs	p	中风后 rs	p
平均拉力	成功率	5	1	<0.001	-0.975	0.005
每分钟拉力回合数	成功率	5	0.3	0.624	-0.154	0.805
累计会话持续时间	成功率	5	-0.1	0.873	0.564	0.322
回合之间的停顿	成功率	5	-0.6	0.285	0.205	0.741
每回合的拉力	成功率	5	0.1	0.873	-0.821	0.089

表 1：变量之间的 Spearman 相关系数。 执行 Spearman 的秩顺序相关性以确定中风前或中风后成功率之间的关系，并确定以下变量：平均峰值、每分钟拉杆次数、累计会话持续时间、回合之间的停顿和每次回合的拉杆次数。在相关性之前，执行了 Shapiro Wilk 检验以评估所有测试变量的成功率是否分布相等，并表明一些变量显着偏离了正态性。除了平均拉力外，中风前的变量与成功率没有有意义的相关性。该表描述了如果成功率与五个测试变量之间存在关系，则评估的 Spearman 相关系数 （ρ） 的结果。

补充文件 1：构建 ORT 的步骤。 打印和构建“一鼠旋转门”的说明。说明中包括所有所需材料的清单以及分步说明（带图像）。该文件还包括将微动开关连接到寄存器入口和出口的说明，以及用于连接 RFID 阅读器的接线和编程。 请点击这里下载此文件。

补充编码文件1： 这包括3D打印“One Rat Turnstile”所需的所有组件。此文件可以直接使用，也可以按照 补充文件 1 中的说明进行访问。此文件中的所有组件都必须使用随附的“标尺”部分进行缩放（有关详细信息，请参阅 补充文件 1 ）。 请点击这里下载此文件。

Discussion

该协议有多种用途。首先，也是最广泛的，ORT 的开发目的是在社会、丰富的住房环境中实现自动化的单主题行为培训和数据收集。虽然这项研究测试了收集典型行为测量并在中风背景下详细阐述它们的想法，但其他应用和行为任务也可以这样做。即使是在此验证中收集的度量，也可以根据需要进行调整，以包括替代强化计划、替代行为等。 其次，这项研究评估了该系统收集与中风后熟练伸展能力受损相关的数据的能力。目前的协议之前已经过验证，用于示教和测量基本杠杆按下¹⁶。目前的数据表明，这是收集中风相关运动缺陷数据的有效方法，并且可以采用传统熟练伸展评估的典型措施以及新的措施。在对菌落笼ORT系统进行故障排除时，一个大问题是动物是否会以足够的频率自行启动行为会话，以及它们是否会在各种实验环境中这样做，特别是在中风后。研究发现，可以鼓励所有或几乎所有动物充分参与简单的操作程序，现在还可以进行中风后行为测试。中风后需要一些手动塑造，但动物很快就在没有实验者在场的情况下恢复了对行为任务的参与。

在故障排除过程中，发现了几个程序点，这些程序点提高了成功的可能性，这些点已被集成到协议中。其中包括需要根据大鼠的大小来调整ORT，并确保动物在社会环境中具有相似的大小和饲养。此外，研究发现，由于腔室的潜在高度竞争，单个 ORT 对于容纳 4-6 只大鼠最有效。值得注意的是，与传统方法相比，这种竞争似乎不会引起更大的压力;之前的一项实验记录了与传统行为测试相比，菌落笼养装置中的皮质醇水平降低¹⁶。此外，研究发现，对于胆小的动物，在初始训练阶段移除旋转门或使其解锁有助于让多只老鼠一起探索房间。

尽管这种方法在评估中风后运动缺陷方面是有效的，但必须承认一些局限性。首先，中风后的动物可能不会立即重新开始拉扯，可能需要几次手动塑形和/或诱饵。使用这种方法和其他特定方法，训练和测试的完全自动化可能会更加困难。然而，这并不是ORT菌落笼子设置所独有的限制，在实验者发起的行为过程中，动物经常会遇到同样的问题。

另一个限制是腔室有可能用于预期目的以外的其他目的。有趣的是，观察到几个例子，动物进入行为室并在里面花费了大量时间而没有积极参与行为任务。这种情况偶尔发生在所有动物身上，但尤其是雄性动物。这可能仅仅是因为当动物不想进行社交活动时，ORT为它们提供了一些隐私。也就是说，使用其他ORT在蜂群笼中添加“单独”的房间可以缓解这个问题。

还观察到，动物偶尔会在隧道中停下来，ORT半开着，并在那里停留一段时间。这就是为什么最好将RFID阅读器靠近行为室的原因，这样动物在完全进入之前不会被登记。可以推测，在 ORT 中徘徊就像挤压滑槽一样令人愉快。在任何情况下，动物都不会以会妨碍数据收集的方式在那里徘徊，特别是当有备用的ORT连接隔离室时。

另一个限制是，自我发起的会话可能更难以均衡群体中个体之间的行为会话时间或行为反应机会。考虑到累积训练时间与恢复之间的关系，这种限制可能与卒中相关研究尤其相关。但是，此限制至少可以部分解决。如果需要实验，可以对许多行为设备进行编程，以在达到目标持续时间或目标反应数量时终止会话（即，通过终止奖励或收回操纵器）。这种解决方案没有解决个人无法达到其目标的任何趋势。但是，同样，这种限制并非此设置所独有。

这种设置还有一个优点，即行为训练或暴露可以在一天中进行，而不是在几个受限的时间内进行。这在几种情况下可能很有用;具体来说，在中风中，它可用于研究行为康复方法的剂量效应。

最后，ORT 可能不能用于厌恶程序，例如社交失败、强迫游泳、条件性恐惧等。ORT 要求行为范式具有吸引力;否则，动物可能会简单地避开行为室。

尽管有局限性，但该程序为目前可用的大鼠行为范式增加了显着优势。首先，该设置允许连续高通量数据收集，同时释放实验人员的时间。虽然持续监测设备和动物很重要，但实验者只需要在一天中的短时间内在场。使用传统方法，对 8 只动物进行行为训练需要每天 4-10 小时的训练。ORT-菌落笼方法不仅将时间减少到几乎为零（假设有一个工作和自动化的设备），而且还允许在周末收集数据，几乎不需要额外的存在;这种周末持续的行为活动也增加了动物可用的总丰富度。

ORT-菌落笼协议提供了数据优势和物流优势。有许多传统上不可能的因变量可用，包括节奏、持续时间或自启动会话的其他参数，例如此处探讨的参数。昼夜节律变量通常使用跑轮来测量;然而，该协议使得在其他类型的行为中查看模式以及选择参数成为可能。ORT甚至可以用来连接群落笼子，并为异性提供视觉或嗅觉上的访问，不仅可以评估动机，还可以评估配偶追求的昼夜节律模式。这项研究表征了几个新的因变量，这些变量可能在中风研究中有用，包括昼夜节律变量和启动相关变量，这些变量可能有助于探索与中风后可能发生的动机丧失和抑郁有关或与之相关的转化问题^34,35。虽然这里没有讨论，但其他重要的中风相关变量，如伸展运动学的定性分析，也应该可以通过运动激活的相机轻松使用这种ORT菌落笼协议进行寻址。

最后，该协议的一个显着优势是它能够让动物在其一生的大部分时间里保持在大型、丰富的社会环境中。动物福利的进步在基础实验室中很重要，这不仅是出于伦理原因，也是出于科学原因。可以四处走动和社交的动物应该作为疾病状态的更好模型，这些疾病状态不会自然涉及限制或剥夺。此外，该协议中行为会话的自给自足性质意味着在收集行为数据时不需要人类在场。人类在实验室中的存在会影响行为数据，有时取决于所讨论的人类、他们的训练程度以及他们如何处理动物 ^2,19。使用当前协议可以最大限度地减少对数据的这种不受控制和可变的影响。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D printer			Consult with local makerspace
bolt	Boltdepot	1346	6-32 or 8-32 by  0.5"
bolt	Boltdepot	1348	6-32 or 8-32 by  0.75"
door hinge	XJS (Amazon)	43398-16234	1" cabinet stainless steel door hinge set; Optional (if "perfect hinge" is not printed)
drill			Any electric drill works
extension spring	Nieko (Amazon)	50456A	Choose and adjust spring based on ORT sized and desired tension
granulated sugar
lock nuts	Boltdepot	2551	6-32 or 8-32
measuring tape
microcontroller	Arduino	A000066	Arduino Uno
microswitch	Sparkfun	KW4-Z5F	mini microswitch (SPDT-roller lever)
One Rat Turnstile (ORT)	Vulintus		Contact company to request quote if not self-assembling
Operant Chambers as desired for behavioral assessment: For this experiment we used automated isometric pull chambers from Vulintus	Vulintus	No cat #: contact Vulintus	Contact Vulintus for quote
PLA filament	OVERTURE (Amazon)	UK-MATTEPLA17511
plexiglass	Lesnlok (Amazon)	B09P74K7BR	clear, 1/8" thickness, Cut to size
plexiglass cutter
python program	Python Software Foundation		software available on request
RFID reader	Priority 1 Design	RFIDRW-E-USB	With antenna
RFID tag	Unified Information Devices	UC-1485-10
rod	Boltdepot	23632	cut to > 3.5"
Rotary tool			Used to bore hole in apparatus and colony caging for ORT; any hardware usable
sand paper	HSYMQ (Amazon)	TOMPOL-1118-1915-11
socket wrench set			Any socket wrench set works
soldering iron
super glue		234790
wire	Plusivo (Amazon)	EAN0721248989789