Her presenterer vi en protokoll med høy gjennomstrømning for å transfeksjonere millioner av maisprotoplaster for testing av store biblioteker av plasmider i maismesofyllceller.
Transfeksjonen av maismesofyllceller innebærer ofte å fordøye plantecelleveggene for å lage protoplaster og deretter sette inn DNA via elektroporering eller polyetylenglykol (PEG). Tidligere metoder ble utviklet for å produsere titusenvis av transfekterte protoplaster samtidig. Her beskriver vi en enkel metode for å isolere og transfektere millioner av bladmesofyllprotoplaster i mais (Zea mays L.). Denne strømlinjeformede prosessen fjerner visse vanlige protopvaringstrinn, for eksempel vasking i W5. I tillegg har trinn som sentrifugering, PEG-mediert transfeksjon og inkubasjon blitt modifisert for å arbeide med et større antall protoplaster . Evnen til å uttrykke store biblioteker av plasmidkonstruksjoner muliggjør genomskalaeksperimenter, for eksempel massivt parallelle reporteranalyser i mais.
Forbigående genuttrykk er et kraftig verktøy i plantebiologi. Imidlertid er planteceller vanskelige å transfektere fordi de er omgitt av en cellevegg. Denne barrieren for DNA-oppføring er ikke tilstede i andre ofte studerte celletyper som pattedyr eller insektceller. Tidligere forskning adresserte denne utfordringen ved å bruke protoplaster: planteceller hvis cellevegger har blitt fordøyd og fjernet. I motsetning til ubehandlet bladvev er planteprotoplaster enkle å arbeide med i suspensjon og egnet til transfeksjonsteknikker mediert av elektroporering eller polyetylenglykol (PEG)1. Planteceller beholder mye av funksjonaliteten selv etter fjerning av celleveggen. Dermed brukes protoplaster i en rekke planter for å studere gen- og proteinfunksjon2,3, for å forstå signaltransduksjon4, og for å identifisere mulige mål for planteavl5. Protoplaster er også et praktisk kjøretøy for screening av genomredigeringskonstruksjoner i forskjellige avlinger, inkludert hvete og potet 6,7. Kort sagt, forbigående analyser i protoplaster er uunnværlige for landbruksbioteknologi.
Mais (Zea mays L.) er den verdensledende kornavlingen etter tonnasje; Som sådan er det et hovedfokus for grunnleggende og anvendt plantevitenskapelig forskning8. Imidlertid, i motsetning til i modellplanter som Nicotiana tabacum9, utføres ikke forbigående transgenuttrykk i intakte maisblader rutinemessig. Protoplasting har blitt brukt til å skaffe og transfektere maisbladmesofyllceller10,11. Tidligere metoder har oppnådd transfeksjonseffektivitet opptil 75% ved bruk av elektroporering og produsert transfeksjonerte protoplaster i skalaen titusenvis10,15.
Denne protokollen beskriver hvordan man protoplast millioner av maismesofyllceller og transfekterer dem med en effektivitet som kan sammenlignes med tidligere metoder. Hovedtrinnene er å dyrke etiolerte maisplanter, høste bladvevet, fordøye plantecelleveggen og levere plasmid-DNA inn i cellene ved hjelp av PEG. Hovedbidraget til denne protokollen er evnen til å skalere opp protoplasttransfeksjon samtidig som cellens levedyktighet opprettholdes for funksjonelle analyser. Dette muliggjør bruk av genomskalaeksperimenter, for eksempel massivt parallelle reporteranalyser, som kan teste funksjonen til hundretusener av regioner i hele maisgenomet. Denne metoden har nylig blitt brukt til å undersøke store biblioteker av cis-regulatoriske DNA-elementer, inkludert forsterkere og promotorer12,13,14.
Som rapportert tidligere er kvaliteten på plantematerialet som brukes til protoplasting avgjørende for å oppnå protoplaster av høy kvalitet16,17,18. Det er viktig å velge sunne, plettfrie blader. Dette arbeidet brukte den populære forskningen maiskultivar B73. Vi har ikke testet andre sorter. Maisplantene som ble brukt til denne protokollen ble dyrket i mørke fordi etiolerte blader produserer protoplaster med større levedyktighet 16 timer etter transfeksjon sammenlignet med protoplaster fra grønne blader. For applikasjoner som ikke krever inkubasjon over natten, vil det være mulig å bruke grønt eller grønt bladmateriale.
Et kritisk trinn er å kutte bladmaterialet riktig i tynne skiver før enzymatisk fordøyelse. Denne prosessen øker overflaten for mesofyllcellene som skal eksponeres for enzymoppløsningen, noe som øker antall gjenvunnede protoplaster . De distale bladspissene kastes, og tynne (≤1 mm) skiver kuttes med nye barberblad, som byttes ut umiddelbart når de begynner å bli kjedelige. For en gitt mengde vev gir tynnere skiver flere protoplaster forutsatt at riktig teknikk brukes for å minimere knusing av bladene.
Det er også viktig å vaske protoplastene riktig, da de er ganske delikate etter å ha gjennomgått fjerning av celleveggen. Etter fordøyelsen holdes alle løsningene på is, og de mørkvoksne protoplaster er beskyttet mot lys. Osmolariteten og pH bufres ved å utføre vaskene i MMG-oppløsning. For å isolere protoplaster fra de mindre tette cellulære ruskene, foregår sentrifugering ved 100 x g. Protoplaster sentrifugert ved 200 x g viser tilsvarende levedyktighet etter isolering, men lavere levedyktighet dagen etter, og de transformerer omtrent halvparten også. Vi anbefaler å sjekke levedyktigheten til protoplaster ved farging med FDA (fluoresceindiacetat) umiddelbart etter isolasjon; Den normale levedyktigheten varierer mellom 70% -90%. Protoplaster med levedyktighet lavere enn 40% etter isolasjon gir få transformanter.
Pelleting og vasking er lettere når du arbeider med mange protoplaster fordi en tydelig synlig pellet oppnås etter transfeksjon. Av denne grunn utføres transfeksjon med 1 million eller flere protoplaster. Ved oppskalering av protokollen bør det velges en beholder av passende størrelse for inkubasjonstrinnene (1,5 ml, 15 ml eller 50 ml sentrifugerør), og volumet av oppløsningen som brukes til vasketrinnene bør skaleres tilsvarende. I alle fall er det fordelaktig å sentrifugere i ≤10 ml alikoter for å sikre at protoplaster ikke forblir i supernatanten. En innovasjon i denne protokollen er fjerning av 1 h inkubasjons- og vasketrinn i W5-løsningen som er oppført i andre protokoller14,19, noe som viste seg å være unødvendig i våre hender.
Som sett i andre studier er mengden og kvaliteten på DNA begge kritiske for vellykket transfeksjon19. For plasmider i 4-6 kb-området brukes 15 μg DNA per 1 million protoplaster. DNA-preparater av dårlig kvalitet kan resultere i redusert levedyktighet etter transfeksjon, så vi anbefaler å bruke et kommersielt DNA-ekstraksjonssett når du isolerer plasmider fra bakterier. Inkubering av protoplaster over natten gjøres ved romtemperatur i mørket for å tillate transkripsjon av plasmid- eller plasmidbiblioteket samtidig som stress minimeres. Etter inkubasjon over natten gjenvinnes omtrent halvparten av opprinnelig transfekterte protoplaster . Protoplaster fortynnes til en konsentrasjon på 500-1000 celler / μL for inkubasjon over natten. Protoplaster igjen for å inkubere over natten ved konsentrasjoner høyere enn 1000 celler / μL har lavere utvinningsgrad og lavere levedyktighet. Ved høyere konsentrasjoner kan rusk fra skadede og døde protoplaster bidra til døden til nærliggende protoplaster . Vasking av protoplaster etter inkubasjon over natten tjener både til å fjerne dette rusket og fjerne overflødig plasmid.
Protokoller som disse har den begrensningen at ikke alle plantearter eller vevstyper er mottagelige for protoplasting. Videre kan forskjeller i genuttrykk induseres av protoplastingsprosessen.
Oppsummert har vi detaljert en enkel og skalerbar protokoll for å isolere og transfektere millioner av levedyktige protoplaster fra stiftjordbruksavlingen Z. mays. Denne metoden kan transfektere mange flere protoplaster ved hjelp av PEG, med en transformasjonseffektivitet nesten like høy som elektroporasjonsbaserte metoder15. Det større netto antallet transformanter muliggjør testing av hundrevis eller tusenvis av konstruksjoner i store eksperimenter som massivt parallelle reporteranalyser12,13. Fremtidige genomskalaeksperimenter i mais vil tillate forskere å bedre forstå maisgenuttrykk og genregulering.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av National Human Genome Research Institute Interdisciplinary Training in Genomic Sciences (T32 opplæringsstipend nr. HG000035 til JT) og National Institute of Health (NIGMS 1R35GM139532 til CQ) og av National Science Foundation (RESEARCH-PGR IOS-1748843 og PlantSynBio 2240888 til CQ). Vi takker Andrea Gallovatti ved Rutgers University for gaven av maisfrøene.
1.5 mL graduated microcentrifuge tubes | VWR | 490004-444 | |
15 mL Falcon conical centrifuge tube | Corning | 05-527-90 | |
250 mL Pyrex glass beaker | Fisher | 50-121-5005 | |
40 um nylon mesh cell strainer | Fisher | 22363547 | |
50 mL Falcon tube | Corning | 14-432-22 | |
72 cell propagation tray | T.O. Plastics | 725607C | |
Aluminum foil | VWR | 89107-732 | |
Bell jar | Bel-Art | F42022-0000 | |
Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5424-R | |
Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-250ML | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature. |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2*2H2O) | PhytoTech Labs | C135 | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature. |
Cellulase Onozuka R-10 | Duchefa Biochemie | C8001.0010 | |
D-Mannitol | PhytoTech Labs | M562 | |
Dissecting scope | Reichert | Microstar IV | |
Fluorescein Diacetate (FDA) | Thermofischer Scientific | F1303 | Dissolve in acetone at 0.5% weight/volume to make a 1000X stock solution. Protect from light and store at -20 °C. |
Fluorescence Illumination Systems | Prior | Lumen200 | |
Fluorescence microscope | Leica | MDG36 | |
High-capacity centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Macerozyme | Duchefa Biochemie | M8002.0005 | |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M292-1KG | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature. |
Maize seeds | B73 | USDA-ARS | https://npgsweb.ars-grin.gov/gringlobal/accessiondetail?accid=PI+550473 |
Medium binder clip | Uline | S-24649 | |
MES | Sigma-Aldrich | M5287-250G | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Adjust pH to 5.7 using KOH. Protect from light and store at room temperature. |
Micropipette 20-200 uL | Gilson | F123601G | |
Nanodrop microvolume spectrophotometer | Thermofischer Scientific | ND-1000 | |
NEB 5-alpha competent E. coli | New England BioLabs | C2987H | |
Neubauer hemocytometer | Daigger Scientific | EF16034F | |
No. 9 Single-edge razor blade | Excel | 20009 | |
Orbital shaker | VWR | 89032-104 | |
Poly(ethylene) glycol 4,000 | Sigma-Aldrich | 81240-1KG | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541-1KG | Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature. |
Professional Grade Vermiculite | NK Lawn & Garden | G208 | |
Round-bottom glass centrifuge tube 30 mL | Kimble Chase | 45500-30 | |
Rubber adapter for Corex centrifuge tubes | Corning | CLS8445AO | |
Sphagnum peat moss | Premier Horticulture | 0128P | |
TRIzol Reagent | Thermofischer Scientific | 15596018 | |
Tygon vacuum tubing | VWR | 76336-844 | |
Vacuum gauge | Wika | 4269978 |