Genetiği Değiştirilmiş Plasmodium berghei Sporozoitlerinin Üretilmesi
Summary
Sıtma, enfekte sivrisinekler tarafından Plasmodium’un sporozoit aşamasının aşılanması yoluyla bulaşır. Transgenik Plazmodyum , sıtmanın biyolojisini daha iyi anlamamızı sağladı ve sıtma aşısı geliştirme çabalarına doğrudan katkıda bulundu. Burada, transgenik Plasmodium berghei sporozoitleri üretmek için aerodinamik bir metodolojiyi açıklıyoruz.
Abstract
Sıtma, parazit Plasmodium’un neden olduğu ölümcül bir hastalıktır ve dişi Anofel sivrisineklerinin ısırması yoluyla bulaşır. Omurgalı konakçıların derisinde sivrisinekler tarafından biriktirilen Plasmodium’un sporozoit aşaması, klinik sıtmaya başlamadan önce karaciğerde zorunlu bir gelişim aşamasına girer. Karaciğerdeki Plasmodium gelişiminin biyolojisi hakkında çok az şey biliyoruz; sporozoit aşamasına erişim ve bu tür sporozoitleri genetik olarak değiştirme yeteneği, Plasmodium enfeksiyonunun doğasını ve karaciğerde ortaya çıkan bağışıklık tepkisini incelemek için kritik araçlardır. Burada, transgenik Plasmodium berghei sporozoitlerinin üretimi için kapsamlı bir protokol sunuyoruz. Kan evresi P. berghei’yi genetik olarak değiştiriyoruz ve bu formu kan yemeği aldıklarında Anofel sivrisineklerini enfekte etmek için kullanıyoruz. Transgenik parazitler sivrisineklerde geliştikten sonra, in vivo ve in vitro deneyler için parazitin sporozoit aşamasını sivrisinek tükürük bezlerinden izole ediyoruz. Yeşil floresan protein (GFP) alt birimi 11’i (GFP11) eksprese eden yeni bir P. berghei suşunun sporozoitlerini üreterek protokolün geçerliliğini gösteriyoruz ve karaciğer evresi sıtmanın biyolojisini araştırmak için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz.
Introduction
İlaç geliştirme ve sıtmanın önlenmesi ve tedavisine yönelik araştırmalardaki ilerlemelere rağmen, sıtmanın küresel hastalık yükü yüksek olmaya devam etmektedir. Her yıl yarım milyondan fazla insan sıtmadan ölüyor ve en yüksek ölüm oranları Sahra altı Afrika gibi sıtmanın endemik olduğu bölgelerde yaşayan çocuklar arasında görülüyor1. Sıtmaya, paraziti tükürük bezlerinde taşıyan dişi Anofel sivrisineklerinin ısırması yoluyla insanlara bulaşan parazit Plasmodium neden olur. Plasmodium’un enfeksiyöz aşaması – sporozoitler – bir kan yemeği sırasında omurgalı konakçıların derisinde birikir ve eritrositleri enfekte etmeden önce zorunlu gelişime (eritrosit öncesi sıtma oluşturan) maruz kaldıkları karaciğer hücrelerini enfekte etmek için kan dolaşımından geçer. Eritrositlerin enfeksiyonu sıtmanın kan evresini başlatır ve hastalıkla ilişkili morbidite ve mortalitenin tamamından sorumludur 2,3.
Plasmodium’un eritrositik gelişiminin zorunlu doğası, onu profilaktik aşı ve ilaç geliştirme çabaları için çekici bir hedef haline getirmiştir4. Pre-eritrositik sıtmanın biyolojisinin yanı sıra karaciğer evresini hedef alan aşıların veya ilaçların geliştirilmesini incelemek için bir ön koşul, Plasmodium sporozoitlerine erişimdir. Ayrıca, genetiği değiştirilmiş Plasmodium sporozoitleri üretme yeteneğimiz, bu tür araştırma çabalarının başarısında etkili olmuştur 5,6,7,8,9. Floresan veya ışıldayan raportör proteinleri eksprese eden Transgenik Plazmodyum hatları, gelişimlerini in vivo ve in vitro olarak izlememize izin verdi 10,11. Plasmodium’daki çoklu genlerin silinmesi yoluyla üretilen genetik olarak zayıflatılmış parazitler (GAP’ler) de en umut verici aşı adaylarından bazılarıdır12,13.
Kemirgen ve insan olmayan primat sıtma modelleri, Plasmodium türleri arasındaki biyoloji ve yaşam döngüsündeki benzerlikler nedeniyle insan sıtmasında konak-parazit etkileşimlerinin mekanizmalarını anlamamıza yardımcı olmuştur14. Kemirgenleri enfekte eden, ancak insanları enfekte etmeyen Plasmodium türlerinin (örneğin, P. berghei) kullanımı, tüm parazit yaşam döngüsünün sürdürülmesine ve kontrollü, biyogüvenlik seviyesi 1 ortamında karaciğer evresi sıtmanın incelenmesi için enfeksiyöz sporozoitlerin üretilmesine izin verir. Transgenik kan evresi Plasmodium parazitlerinin15, sivrisineklerin16 enfeksiyonu ve sporozoitlerin17 izolasyonu için çeşitli ayrı protokoller zaten mevcuttur. Burada, örnek olarak yeni transgenik suş PbGFP11’i kullanarak, transgenik P. berghei sporozoitlerini üretmek ve izole etmek için bu metodolojileri birleştiren kapsamlı bir protokolün ana hatlarını çiziyoruz. PbGFP 11, süper klasör yeşil floresan proteinin (GFP) 11. β iplikçiğini, GFP11’i, konakçı hepatositlerde üretilen parazitoforöz vakuole (PV) aktarır. PbGFP 11, sitoplazmada (Hepa GFP 1-10 hücreleri) GFP 1-10 fragmanını (GFP 1-10) oluşturan kalıntıları eksprese eden transgenik hepatositler (Hepa1-6 arka planı) ile birlikte kullanılır. PbGFP11, kendi kendini tamamlama ve fonksiyonel GFP ve yeşil floresan sinyalinin18 yeniden oluşturulması yoluyla konakçı hepatositlerde PV lizizini bildirir. GFP 11’in, ortaya çıkan floresan sinyalini geliştirmek için PbGFP11’de yedi tandem dizisinden oluşan bir dizi olarak kodlandığını unutmayın. PbGFP11 sporozoitlerini sitoplazmik boya CellTrace Violet (CTV) ile boyadıktan sonra parazitleri izleyebiliriz. Bu tür CTV ile boyanmış hücre içi parazitlerin parçalanması, CTV’nin konak hücre sitoplazmasına sızmasına ve konak hücrenin boyanmasına neden olur. Plasmodium PV ve/veya konakçı hepatositlerdeki parazitin parçalanmasını görselleştirmeye ve ayırt etmeye ek olarak, bu sistem, bu yolların moleküler bileşenlerinin genetik veya terapötik bozulması yoluyla, bu süreçlerden herhangi birinden sorumlu bağışıklık yollarını incelemek için güvenilir bir şekilde kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Laboratuvarımızda birkaç transgenik P. berghei paraziti hattı oluşturmak için yukarıdaki protokolü kullandık. P. berghei için optimize edilmiş olmasına rağmen, bu protokolü transgenik P. yoelii sporozoitleri üretmek için de başarıyla kullandık. Transfekte edilen şizontları farelere enjekte ettikten sonra, parazitler tipik olarak en geç 3 d.p.i. plazmid kontrolü de dahil olmak üzere tüm gruplarda. Elektroporasyonu takiben parazitlerin yaşayabilirliğini sağlamak için …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından SPK’ya AI168307 desteklenmiştir. UGA CTEGD Akış Sitometrisi Çekirdeğine ve UGA CTEGD Mikroskopi Çekirdeğine teşekkür ederiz. Ayrıca Ash Pathak, Anne Elliot ve UGA Sporocore personelinin protokolü optimize etmedeki katkılarını da takdir ediyoruz. Değerli içgörüler, tartışmalar ve GFP 11 ve GFP 1-10 içeren ana plazmitler için Dr. Daichi Kamiyama’ya teşekkür etmek istiyoruz. Ayrıca Kurup laboratuvarı üyelerine sürekli destekleri, sabırları ve teşvikleri için teşekkür ederiz.
Materials
| 30 G x 1/2" Syringe needle | Exel international | 26437 | |
| Alsever's solution | Sigma-Aldritch | A3551-500ML | |
| Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2 | Lonza | VMI-1021 | |
| Avertin (2,2,2-Tribromoethanol) | TCI America | T1420 | |
| Blood collection tubes | BD bioscience | 365967 | for serum collection |
| C-Chip disposable hematocytometer | INCYTO | DHC-N01-5 | |
| CellVeiw Cell Culture Dish | Greiner Bio-One | 627860 | |
| Centrifuge 5425 | Eppendorf | 5405000107 | |
| Centrifuge 5910R | Eppendorf | 5910R | For gradient centrifugation |
| Delta Vision II – Inverted microscope system | Olympus | IX-71 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D5879-500ml | |
| Fetal bovine serum | GenClone | 25-525 | |
| GFP11 plasmid | Kurup Lab | pSKspGFP11 | Generated from PL0017 plasmid |
| Giemsa Stain | Sigma-Aldritch | 48900-1L-F | |
| Hepa GFP1-10 cells | Kurup Lab | Hepa GFP1-10 | Generated from Hepa 1-6 cells (ATCC Cat# CRL-1830) |
| Mouse Serum | Used for mosquito dissection media | ||
| NaCl | Millipore-Sigma | SX0420-5 | 1.5 M and 0.15 M for percoll solution |
| Nucleofector II | Amaxa Biosystems (Lonza) | Program U-033 used for RBC electroporation | |
| Pasteur pipette | VWR | 14673-043 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldritch | P0781-100ML | |
| Percoll (Density gradient stock medium) | Cytivia | 17-0891-02 | Details in protocol |
| PL0017 Plasmid | BEI Resources | MRA-786 | |
| Pyrimethamine (for oral administration) | Sigma | 46706 | Preparation details: Add 17.5 mg Pyrimethamine to 2.5 mL of DMSO. Vortex, if needed to dissolve completely; Adjust pH of 225 mL of dH2O to 4 using HCL. Add Pyrimethamine in DMSO to water and bring to 250 mL. Add 10 g of sugar to encourage regular consumption of drugged water. Pyrimethamine is light sensitive. Use dark bottle or aluminum foil covered bottle when treating mice. |
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| SoftWoRx microscopy software | Applied Precision | v6.1.3 |
References
- WHO. Geneva. World Health Organization. , 1 (2020).
- Cowman, A. F., Healer, J., Marapana, D., Marsh, K. Malaria: biology and disease. Cell. 167 (3), 610-624 (2016).
- Crompton, P. D., et al. Malaria immunity in man and mosquito: insights into unsolved mysteries of a deadly infectious disease. Annual Review of Immunology. 32, 157-187 (2014).
- Marques-da-Silva, C., Peissig, K., Kurup, S. P. Pre-erythrocytic vaccines against malaria. Vaccines. 8 (3), 400 (2020).
- Balu, B., Adams, J. H. Advancements in transfection technologies for Plasmodium. International Journal for Parasitology. 37 (1), 1-10 (2007).
- Rodriguez, A., Tarleton, R. L. Transgenic parasites accelerate drug discovery. Trends in Parasitology. 28 (3), 90-92 (2012).
- Voorberg-vander Wel, A. M., et al. A dual fluorescent Plasmodium cynomolgi reporter line reveals in vitro malaria hypnozoite reactivation. Communications Biology. 3, 7 (2020).
- Christian, D. A., et al. Use of transgenic parasites and host reporters to dissect events that promote interleukin-12 production during toxoplasmosis. Infection and Immunity. 82 (10), 4056-4067 (2014).
- Montagna, G. N., et al. Antigen export during liver infection of the malaria parasite augments protective immunity. mBio. 5 (4), e01321 (2014).
- Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. In vivo imaging of malaria parasites-recent advances and future directions. Current Opinion in Microbiology. 8 (4), 407-414 (2005).
- Siciliano, G., Alano, P. Enlightening the malaria parasite life cycle: bioluminescent Plasmodium in fundamental and applied research. Frontiers in Microbiology. 6, 391 (2015).
- Othman, A. S., et al. The use of transgenic parasites in malaria vaccine research. Expert Review of Vaccines. 16 (7), 1-13 (2017).
- Kreutzfeld, O., Muller, K., Matuschewski, K. Engineering of genetically arrested parasites (GAPs) for a precision malaria vaccine. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 198 (2017).
- Otto, T. D., et al. A comprehensive evaluation of rodent malaria parasite genomes and gene expression. BMC Biology. 12, 86 (2014).
- Janse, C. J., Ramesar, J., Waters, A. P. High-efficiency transfection and drug selection of genetically transformed blood stages of the rodent malaria parasite Plasmodium berghei. Nature Protocols. 1 (1), 346-356 (2006).
- Tripathi, A. K., Mlambo, G., Kanatani, S., Sinnis, P., Dimopoulos, G. Plasmodium falciparum gametocyte culture and mosquito infection through artificial membrane feeding. Journal of Visualized Experiments. (161), e61426 (2020).
- Pacheco, N. D., Strome, C. P., Mitchell, F., Bawden, M. P., Beaudoin, R. L. Rapid, large-scale isolation of Plasmodium berghei sporozoites from infected mosquitoes. The Journal of Parasitology. 65 (3), 414-417 (1979).
- Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
- Bailey, J. W., et al. Guideline: the laboratory diagnosis of malaria. General Haematology Task Force of the British Committee for Standards in Haematology. British Journal of Haematology. 163 (5), 573-580 (2013).
- Das, D., et al. A systematic literature review of microscopy methods reported in malaria clinical trials. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 104 (3), 836-841 (2020).
- de Oca, M. M., Engwerda, C., Haque, A. Plasmodium berghei ANKA (PbA) infection of C57BL/6J mice: a model of severe malaria. Methods in Molecular Biology. 1031, 203-213 (2013).
- Musiime, A. K., et al. Is that a real oocyst? Insectary establishment and identification of Plasmodium falciparum oocysts in midguts of Anopheles mosquitoes fed on infected human blood in Tororo, Uganda. Malaria Journal. 18 (1), 287 (2019).
- Marques-da-Silva, C., et al. Direct type I interferon signaling in hepatocytes controls malaria. Cell Reports. 40 (3), 111098 (2022).
- Bowers, C., et al. Cryopreservation of Plasmodium sporozoites. Pathogens. 11 (12), 1487 (2022).
- Zander, R. A., et al. Th1-like plasmodium-specific memory CD4+ T cells support humoral immunity. Cell Reports. 21 (7), 1839-1852 (2017).
