Summary
Este protocolo fornece instruções para o desencadeamento e monitoramento da pexefagia mediada por Stub1 em células vivas.
Abstract
Células de mamíferos podem transformar peroxissomas através da pexofagia mediada por Stub1. A via potencialmente permite o controle celular da quantidade e qualidade dos peroxissomos. Durante esse processo, a proteína de choque térmico 70 e a ubiquitina E3 ligase, Stub1, translocam-se em peroxissomas para serem viradas para iniciar a pexofagia. A atividade da ligase Stub1 permite o acúmulo de ubiquitina e outros módulos relacionados à autofagia em peroxissomas alvo. A elevação dos níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs) dentro da luz peroxissomal pode ativar a pexofagia mediada por Stub1. Pode-se, portanto, usar a geração de ROS assistida por corante para desencadear e monitorar essa via. Este artigo descreve os procedimentos para o uso de duas classes de corantes, proteínas fluorescentes e fluoróforos sintéticos, para iniciar a pexofagia em culturas de células de mamíferos. Esses protocolos baseados na geração de ROS assistida por corante podem não apenas ser usados para atingir todos os peroxissomas dentro de uma população celular globalmente, mas também podem permitir a manipulação de peroxissomas individuais dentro de células únicas. Também descrevemos como a pexofagia mediada por Stub1 pode ser acompanhada usando microscopia de células vivas.
Introduction
Os peroxissomas são organelas ligadas a uma única membrana presentes na maioria das células eucarióticas. Os peroxissomas são um compartimento metabólico essencial para a realização da beta-oxidação de ácidos graxos de cadeia muito longa, catabolismo de purinas e síntese de fosfolipídios éteres e ácidos biliares1. O acetil-CoA derivado do peroxissomo controla a homeostase lipídica regulando a sinalização central no metabolismo2. Portanto, não é surpresa que o comprometimento das funções peroxissomais esteja implicado em várias doenças, incluindo doenças neurodegenerativas, envelhecimento, cânceres, obesidade e diabetes 3,4,5. Um processo essencial na manutenção da operação peroxissomal é a pexofagia. A puxofagia é um processo catabólico para o turnover seletivo de peroxissomas por autofagia. As células usam a pexofagia para ajudar a controlar a quantidade e a qualidade dos peroxissomos, garantindo assim a função peroxissomal adequada. Um estudo recente demonstrou que a perda de peroxissomo causada por mutações nos fatores 1 e 6 da biogênese peroxissomal PEX1 resulta de pexofagia não controlada6. Notavelmente, 65% de todos os pacientes com transtorno da biogênese do peroxissomo (DBP) apresentam deficiências no complexo ATPase AAA peroxissomal, composto por PEX1, PEX6 e PEX26em células de mamíferos7.
Vários métodos podem ser usados para iniciar e estudar a pexofagia. Em leveduras, a pexofagia é desencadeada quando os nutrientes fornecidos são trocados de fontes de carbono dependentes de peroxissomo para fontes de carbono independentes de peroxissomo (para diminuir o número de peroxissomas celulares)8. Por exemplo, a transferência de células de Pichia pastoris cultivadas com metanol do meio metanol para o meio glicosado e etanol induz micropexofagia e macropexofagia, respectivamente 8,9,10. A micropexofagia sequestra peroxissomas agrupados para degradação, remodelando o vacúolo para formar membranas de sequestro vacuolar em forma de taça e uma estrutura semelhante a uma tampa denominada aparato de membrana específico para micropexofagia (MIPA). Na macropexofagia, os peroxissomas individuais são engolidos por estruturas de membrana dupla conhecidas como pexofagossomos, seguidos de fusão com o vacúolo para degradação 8,9,10. A fosforilação de receptores de pexofagia, como Atg36p em Saccharomyces cerevisiae e Atg30p em Pichia pastoris, é crítica para recrutar maquinaria de autofagia central e facilitar o direcionamento peroxissomal para autofagossomos 8,11.
Em células de mamíferos, a pexofagia pode ser induzida por ubiquitinação. A marcação das proteínas da membrana peroxissomal PMP34 ou PEX3 com ubiquitina no lado citosólico induz a pexofagia12. A superexpressão de PEX3 induz a ubiquitinação do peroxissomo e a eliminação do peroxissomo pelos lisossomos13. Além disso, a fusão de PEX5 com um EGFP C-terminal prejudica a exportação de PEX5 monoubiquitinado e resulta em pexofagia14. Por outro lado, a pexofagia também pode ser desencadeada pelo tratamento com H 2 O2. Os peroxissomas produzem espécies reativas de oxigênio (EROs); especificamente, a enzima peroxissomal Acox1, que catalisa a etapa inicial da beta-oxidação de ácidos graxos de cadeia muito longa (carbono > 22), produz não apenas acetil-CoA, mas também ROS peroxissomal. Em resposta aos níveis elevados de ROS sob o tratamento comH 2 O2, as células de mamíferos ativam a pexofagia para diminuir a produção de ROS e aliviar o estresse. Tem sido relatado que o tratamento com H 2 O2direciona o recrutamento de ataxia-telangiectasia mutada (ATM) para peroxissomas. A ATM fosforila então PEX5 para promover o turnover peroxissomal pela pexofagia15.
Como os peroxissomas são centros geradores de ROS, eles também são propensos a danos de ROS. Lesões peroxissomais provocadas por ERO forçam as células a ativar a pexofagia para iniciar vias de controle de qualidade do peroxissomo (remoção do peroxissomo danificado por autofagia). Aqui, delineamos uma abordagem para o desencadeamento sob demanda de lesão peroxissomal provocada por ROS. O protocolo aproveita a produção de ERO ativadas por luz dentro de organelas 16,17,18,19,20 (Figura 1). Os peroxissomas marcados com corante são iluminados, levando à produção de ERO dentro da luz peroxissomal, o que desencadeia especificamente a lesão peroxissomal. Usando este protocolo, mostra-se que os peroxissomas estressados por ROS são removidos através de uma via de degradação dependente de ubiquitina. Os peroxissomas estressados com ROS recrutam a ubiquitina E3 ligase Stub1 para permitir seu engolfamento em autofagossomos para remoção individual por pexofagia16. Pode-se usar este protocolo para comparar o destino de peroxissomas lesionados e saudáveis dentro de uma mesma célula por microscopia de lapso de tempo. O método também pode ser usado para danificar globalmente todos os peroxissomas (em todas as células) em uma placa de cultura, permitindo a análise bioquímica da via da pexofagia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo detalha como desencadear a pexofagia mediada por Stub1 em culturas de células elevando os níveis de ROS peroxissomais com luz. Como o protocolo depende da geração de ROS assistida por corante, é necessário garantir a expressão suficiente de diKillerRed-VKSKL ou coloração de ligante SLP marcada com corante dentro das células de interesse. Dado que diferentes tipos celulares ou células de diferentes origens genéticas podem abrigar peroxissomas com propriedades ligeiramente diferentes, pode-se pre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado em parte por uma bolsa de pesquisa MOST 111-2311-B-001-019-MY3 do Conselho Nacional de Ciência e Tecnologia de Taiwan.
Materials
| 35 mm culture dish with a 20 mm diameter glass microwell | MatTek | P35G-1.5-20-C | 20 mm glass bottomed |
| 3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) | Sigma Aldrich | A8056 | |
| bovine serum | ThermoFisher Scientific | 16170060 | |
| Cell culture incubator | Nuaire | NU-4750 | |
| diKillerRed-PTS1 | Academia Sinica | made by appending the KillerRed tandem dimer with PTS1(VKSKL) | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) | ThermoFisher Scientific | 11330032 | |
| EGFP-C1 | Clontech | pEGFP-C1 | The backbone of EGFP-C1 was used for cloning EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62 |
| EGFP-Hsp70 | Academia Sinica | Hsp70 gene (HSPA1A) PCR amplified from HeLa cDNA and cloned into EGFP-C1 | |
| EGFP-LC3B | Addgene | 11546 | |
| EGFP-p62 | Academia Sinica | generated by inserting the human SQSTM1 gene (through PCR amplification of the HeLa cell cDNA) into EGFP-C1 | |
| EGFP-Stub1 | Academia Sinica | generated by inserting the mouse Stub1 gene (through PCR amplification of the total mouse kidney cDNA) into EGFP-C1 | |
| EGFP-Ub | Addgene | 11928 | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| HaloTag TMR ligand | Promega | G8252 | |
| HaloTag-PTS1 | Academia Sinica | PTS1 appended and cloned into EGFP-C1 backbone | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | |
| Inverted Confocal Microscope | Olympus | FV3000RS | 405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex, microscope with a TOKAI HIT chamber incubator and the UNIV2-D35 dish attachment |
| Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand | Promega | GA1120 | |
| LED | VitaStar | PAR64 | 80 W, 555-570 nm |
| lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific | 11668 | transfection reagent |
| NIH3T3 cell | ATCC | CRL-1658 | adherent |
| Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 319850 | reduced serum media |
| penicillin/streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140 | |
| PMP34-TagBFP | Academia Sinica | PMP34 PCR amplified from HeLa cDNA and cloned intoTagBFP-C (Evrogen FP171) | |
| roGFP2-PTS1 | Academia Sinica | generated by appending eroGFP (taken from Addgene plasmid 20131) with the amino acid sequence VKSKL, and cloned into the EGFP-C1 | |
| SHSY5Y cell | ATCC | CRL-2266 | adherent |
References
- Wanders, R. J., Waterham, H. R., Ferdinandusse, S. Metabolic interplay between peroxisomes and other subcellular organelles including mitochondria and the endoplasmic reticulum. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 83 (2016).
- He, A., et al. Acetyl-CoA derived from hepatic peroxisomal β-oxidation inhibits autophagy and promotes steatosis via mTORC1 activation. Molecular Cell. 79 (1), 30.e4-42.e4 (2020).
- Cipolla, C. M., Lodhi, I. J. Peroxisomal dysfunction in age-related diseases. Trends in Endocrinology & Metabolism. 28 (4), 297-308 (2017).
- Fransen, M., Nordgren, M., Wang, B., Apanasets, O., Veldhoven, P. P. V. Aging, age-related diseases and peroxisomes. Peroxisomes and their Key Role in Cellular Signaling and Metabolism. 69, 45-65 (2013).
- Puri, P., et al. The plasma lipidomic signature of nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 50 (6), 1827-1838 (2009).
- Law, K. B., et al. The peroxisomal AAA ATPase complex prevents pexophagy and development of peroxisome biogenesis disorders. Autophagy. 13 (5), 868-884 (2017).
- Nazarko, T. Y. Pexophagy is responsible for 65% of cases of peroxisome biogenesis disorders. Autophagy. 13 (5), 991-994 (2017).
- Eberhart, T., Kovacs, W. J. Pexophagy in yeast and mammals: An update on mysteries. Histochemistry and Cell Biology. 150 (5), 473-488 (2018).
- Manjithaya, R., Nazarko, T. Y., Farré, J. -. C., Subramani, S. Molecular mechanism and physiological role of pexophagy. FEBS Letters. 584 (7), 1367-1373 (2010).
- Till, A., Lakhani, R., Burnett, S. F., Subramani, S. Pexophagy: The selective degradation of peroxisomes. International Journal of Cell Biology. 2012, 512721 (2012).
- Germain, K., Kim, P. K. Pexophagy: A model for selective autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (2), 578 (2020).
- Kim, P. K., Hailey, D. W., Mullen, R. T., Lippincott-Schwartz, J. Ubiquitin signals autophagic degradation of cytosolic proteins and peroxisomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20567-20574 (2008).
- Yamashita, S., Abe, K., Tatemichi, Y., Fujiki, Y. The membrane peroxin PEX3 induces peroxisome-ubiquitination-linked pexophagy. Autophagy. 10 (9), 1549-1564 (2014).
- Nordgren, M., et al. Export-deficient monoubiquitinated PEX5 triggers peroxisome removal in SV40 large T antigen-transformed mouse embryonic fibroblasts. Autophagy. 11 (8), 1326-1340 (2015).
- Zhang, J., et al. ATM functions at the peroxisome to induce pexophagy in response to ROS. Nature Cell Biology. 17 (10), 1259-1269 (2015).
- Chen, B. -. H., Chang, Y. -. J., Lin, S., Yang, W. Y. Hsc70/Stub1 promotes the removal of individual oxidatively stressed peroxisomes. Nature Communications. 11 (1), 5267 (2020).
- Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover. Nature Communications. 4, 2111 (2013).
- Mageswaran, S. K., Yang, W. Y., Chakrabarty, Y., Oikonomou, C. M., Jensen, G. J. A cryo-electron tomography workflow reveals protrusion-mediated shedding on injured plasma membrane. Science Advances. 7 (13), eabc6345 (2021).
- Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled initiation of parkin-mediated mitophagy within single cells. Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).
- Yang, J. Y., Yang, W. Y. Bit-by-bit autophagic removal of parkin-labelled mitochondria. Nature Communications. 4, 2428 (2013).
- Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
- Lismont, C., Walton, P. A., Fransen, M. Quantitative monitoring of subcellular redox dynamics in living mammalian cells using RoGFP2-based probes. Methods in Molecular Biology. 1595, 151-164 (2017).
- Nordgren, M., et al. Potential limitations in the use of KillerRed for fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 245 (3), 229-235 (2012).
