该协议描述了如何建立,维持,基因修饰,分化,功能表征和移植源自原代小鼠和人体组织的泪腺类器官。
泪腺是眼表稳态的重要器官。通过产生泪膜的水性部分,它可以保护眼睛免受干燥应力和外部侮辱。由于缺乏足够的 体外 模型,对泪腺(病理)生理学知之甚少。类器官技术已被证明是多个器官的有用实验平台。在这里,我们分享了一个从泪腺活检开始建立和维护小鼠和人泪腺类器官的方案。通过改变培养条件,我们增强了泪腺类器官的功能。类器官功能可以通过“哭泣”测定来探测,该测定涉及将泪腺类器官暴露于选定的神经递质以触发其腔中的泪液释放。我们解释了如何对这种现象进行成像和量化。为了研究感兴趣的基因在泪腺稳态中的作用,这些基因可以进行基因改造。我们彻底描述了如何使用碱基编辑器对泪腺类器官进行基因修饰 – 从指南RNA设计到类器官克隆基因分型。最后,我们展示了如何通过原位植入小鼠来探测人泪腺类器官的再生潜力。总之,这个全面的工具集提供了使用小鼠和人类泪腺类器官来研究泪腺(病理)生理学的资源。
泪腺是负责产生泪膜大部分水层的腺上皮1。泪膜的水层不仅含有润滑眼表的水,还含有大量抗菌成分,可保护眼表免受感染2。当泪腺受损或发炎时,会发生干眼症,这会导致患者不适,并最终导致视力丧失3。多年来,研究泪腺,特别是人类腺体的模型系统一直受到限制4,5,6。这导致了关于生理和病理条件下泪腺功能的知识差距。
最近,已经开发了体外模型来研究培养皿中的泪腺7,8,9。这些泪腺类器官来源于在细胞外基质中以三维结构生长的成体干细胞,并辅以生长因子混合物,以维持其在体外的再生能力7。成体干细胞(ASC)衍生类器官的优点是它们可以维持很长时间,同时概括健康的组织特征。这种类型的类器官仅由上皮细胞组成,这与诱导多能干细胞(iPSC)衍生的类器官不同,后者也可能含有基质细胞。与多能干细胞(PSC)衍生的类器官不同,ASC类器官直接从成人组织建立,不需要任何遗传修饰即可扩增。ASC类器官表达成人特征10.
该协议包含一个工具箱,用于从小鼠和人类原代组织中提取泪腺类器官。该协议描述了如何通过简单的生长因子提取来进一步增强类器官的功能,以及如何通过进行肿胀测定来激发类器官分泌泪液。该协议还包括一种基于电穿孔的转染方法,用于使用CRISPR衍生的碱基编辑器对小鼠类器官进行基因工程。与传统的Cas9不同,使用碱基编辑器允许修饰基因组中的单个碱基,而不会产生双链断裂11,12。最后,描述了将人泪腺类器官原位移植到免疫缺陷小鼠中以及随后对植入物的组织学评估。该泪腺类器官工具包可用于泪腺再生和功能研究以及遗传和炎症疾病建模。
该协议描述了泪腺类器官的建立和使用,用于功能测定,突变建模和移植。在建立小鼠和人泪腺类器官时,组织解离至关重要。如果组织没有被充分消化,类器官产量就会很低。如果组织被过度消化,细胞就会死亡,不会以类器官的形式生长出来。每个组织应用特定酶消化特定时间,以确保最佳的类器官生长14,17,18。泪腺是一种相当柔软的组织,5-10分钟的胶原酶消化结合基于移液的机械解离足以分离小块组织。如果需要获得单细胞用于单细胞RNA测序等应用,解离可以进行更长时间,直到达到单细胞阶段,但一旦获得单细胞,应立即停止解离,以限制活力的任何降低。由于组织解离至关重要,过度消化是泪腺类器官建立失败的最可能原因。
泪腺类器官的适当维护对其使用很重要。与诱导多能干细胞衍生类器官相比,长期维持是成体干细胞来源的泪腺类器官的标志7,17。为了实现长期维持,应定期进行类器官分裂和培养基更换。没有这一点,类器官开始分化并发展出降低的干细胞潜力,这阻碍了它们的长期维持7。在这一步,过度消化会杀死干细胞并损害类器官的维持。对于定期维护,不需要将类器官解离成单个细胞。然而,要产生克隆敲除类器官系,从单细胞开始至关重要。如果没有,类器官将由具有不同遗传背景的细胞马赛克组成,使得分析单个定义的突变的影响变得不可能。在这里,我们描述了使用 C > T 碱基编辑器来生成终止密码子。该基因组编辑器依赖于NGG PAM的12-18个碱基内精氨酸,谷氨酰胺或色氨酸密码子的存在。当在设计gRNA时不满足这些条件时,可以使用具有替代PAM的常规Cas9或C >T碱基编辑器7,18。然而,传统的Cas9引入了双链断裂,导致修复时产生插入缺失11。由于两个等位基因可能携带不同的插入缺失,克隆基因分型需要格外小心。应执行引入修饰的反卷积,以确保两个等位基因都包含帧外插入缺失,因此,类器官克隆针对靶向基因19进行敲除。C > T 碱基编辑器的优势在于它们可用于模拟不一定导致终止密码子的点突变。例如,它们可用于模拟在无虹膜患者中发现的特定Pax6突变,以研究它们对泪腺生理学的影响20。
泪腺分泌泪膜的水部分1。在生长因子撤出和NOTCH抑制介导的分化后,泪液分泌可以在人类器官中重现。在这些条件下,类器官经历末端分化,无法进一步维持。然而,分化的泪腺类器官可以指导干眼症背景下催泪药物的开发,可能在高通量筛查中。该协议中提出的撕裂测定是目前在短时间内类器官大小变化最大的测定,这使得在药物筛选的背景下更容易量化7,9,17。
干细胞疗法在干眼症中泪腺再生方面具有巨大前景21。成体干细胞衍生的泪腺类器官可以作为此类应用的源材料。这里介绍的方案导致人泪腺类器官植入,主要是囊肿。由于类器官被注射到错误的部位,可能会出现类器官植入率低。用染料训练注射过程可以跟踪注射部位,并最终提高注射精度。或者,可以切开小鼠表皮以直接进入泪腺,就像在22岁之前的大鼠所做的那样。此方法需要更长的时间,但可能更准确。另一方面,使用本协议,类器官在功能上没有整合到小鼠泪腺中。对于 iPSC 衍生的泪腺植入术也观察到了类似的结果22.通过提前损伤泪腺,使用干眼小鼠模型和/或将类器官作为单细胞或小团块注射,可以进一步改进移植方法。然而,成体干细胞来源的泪腺类器官和相关工具包可以成为未来在泪腺研究和再生医学中应用的基础。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢Yorick Post对协议的初步开发。这项工作部分得到了英国癌症研究大挑战赛(C6307 / A29058)和马克癌症研究基金会对SPECIFICANCER团队的奖励的支持。
1.5 mL safe-lock centrifuge tubes | Eppendorf | EP0030 120.094 | |
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate (DAB) | Sigma-Aldrich | D5637 | CAS: 868272-85-9 , CAUTION, 6 g/L solution can be stored aliquotted at -20 °C |
5x green GoTaq Flexi buffer | Promega | M891A | Store at -20 °C |
A83-01 | Tocris | 2939 | Store at -20 °C, stock at 30 mM, 10000x |
Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | store at 4 °C |
Agar plates containing Ampicillin | Hubrecht Institute | ||
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | |
Autoclave VAPOUR-Line lite | VWR chemicals | ||
B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | Store at -20 °C, 50x |
BD Micro-Fine insulin needle 1 mL | BD Bioscience | 324825 | |
Benchtop microscope DMI1 | Leica | ||
Bovine serum albumine (BSA) | MP biomedicals | 160069 | Store at 4 °C |
BTXpress | BTX | MDS450805 | |
C57BL/6 mice | Hubrecht Institute | ||
Cassettes | Klinipath | 410-02S | |
CellBanker 1 | amsbio | 11910 | Cryopreservation medium, adhere to instructions |
Centrifuge | Eppendorf | ||
Citric acid monohydrate | J.T. Baker | 0088 | CAS: 5949-29-1 |
Collagenase I | Sigma Aldrich | C9407 | Aliquots at 20 mg/mL, 20x, store at -20 °C |
Conical tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 5618-8271 | |
Conical tubes 50 mL | Corning | CLS430828-500EA | |
Coverslips 24 mm x 50 mm | Menzel-Gläzer | BB024050S1 | |
Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Growth Factor Reduced, Type 2 – extracellular matrix | R&D Systems, Bio-Techne | 3533-001-02 | Store at -20 °C, keep at 4 °C for up to 1 month |
DAPT | Sigma Aldrich | D5942 | Store at -20 °C, stock at 10 mM, 1000x |
Disodium hydrogen phosphate anhydrous | VWR chemicals | 28026.292 | CAS: 7558-79-4 |
Di-sodiumhydrogenphosphate dihydrate | Sigma-Aldrich | 71643 | CAS:10028-24-7 |
Dispase | ThermoFisher Scientific | 17105-041 | Aliquots at 50 U/mL, store at -20 °C until use, 400x |
Disposable Scalpel Sterile N° 10 | Swann Morton | 3033838 | |
DM4000 microscope | Leica | ||
dNTPs 25 mM | Promega | U1420 | Mix all 4 nucleotides together, Store at -20 °C |
Dpn1 | New England Biolabs | R0176 | |
Dulbecco's Phosphate-bufferd Saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | 1x |
Easy strainers 70 µm | Greiner | 542170 | |
Electroporation cuvette | Nepagene | EC002S | |
EnVision+/HRP mouse | Agilent | K400111-2 | |
Ethanol 100% | BOOM | 84045206;5000 | CAUTION, Use to prepare other Ethanol dilutions |
Ethanol 70% | BOOM | 84010059.5000 | CAUTION |
Ethanol 96% | BOOM | 84050065.5000 | CAUTION |
EVOS FL Auto 2 Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | Live-imaging brightfield microscrope | |
FGF10 | Peprotech | 100-26 | Store at -20 °C, stock at 100 mg/mL in base medium, 100x |
Fiji | NIH, Fiji developers | ||
Formaldehyde solution 4% | Sigma-Aldrich | 1.00496 | CAS: 50-00-0, CAUTION |
Forskolin | Tocris | 1099 | Store at -20 °C, stock at 10 mM, 10000x |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | 100x |
GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase | Promega | M7805 | Store at -20 °C |
Haematoxylin | VWR chemicals | 10047105 | Store at room temperature |
HEPES | Gibco | 15630-080 | Store at 4 °C, 100x |
Histocore H and C, Tissue embedding machine | Leica | ||
Hot plate | Meidax | ||
Human nucleolar antigen antibody | Abcam | ab-190710 | |
Hydrochloric acid 5 N | ThermoFisher Scientific | 10605882 | CAS: 7647-01-0, CAUTION |
Hydrogen peroxyde 30% | Chem-lab | CL00.2308.1000 | CAS: 7722-84-1, CAUTION |
Hygromycin B-gold | InvivoGen | ant-hg | Stock at 100 mg/µL, 1000x |
Hygromycin resistance cassette-containing plasmid | Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156 | ||
IsoFlo 100% | Mecan | 5960501 | |
LB medium | Hubrecht Institute | ||
MgCl2 25 mM | Promega | A351H | Store at -20 °C |
Microtome RM2235 | Leica | ||
Midiprep DNA isolation kit | ThermoFisher Scientific | K210005 | |
Miniprep DNA isolation kit | ThermoFisher scientific | K210003 | |
N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165 | Store at -20 °C, stock at 500 mM, 400x |
NEPA21 electroporator | Nepagene | ||
Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | Store at -20 °C, stock at 1M, 100x |
NOD Scid Gamma (NSG) mice | Hubrecht Institute colony | ||
Noggin conditioned medium | U-Protein Express | Custom order | Store at -20 °C |
Noradrenaline | Sigma Aldrich | A7257 | Store at -20 °C, stock at 100 mM |
Oven | Memmert | Set at 58 °C | |
P20, P200 and P1000 pipettes | Gilson | ||
Paraffin | VWR chemicals | 10048502 | |
Pasteur pipettes, glass plugged | ThermoFisher Scientific | 1150-6973 | |
Pax6_C>T_F: AGACTGTTCCAGGATGGCTG | IDT | ||
Pax6_C>T_R: TCTCCTAGGTACTGGAAGCC | IDT | ||
pCMV_ABEmax_P2A_GFP | Addgene | 112101 | |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Store at -20 °C |
Pertex | Klinipath | AM-08010 | |
pFYF1320 | Addgene | 47511 | |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1000X, store at -20 °C |
Prostaglandin E2 (PGE2) | Tocris | 2296 | Store at -20 °C, stock at 10 mM, 10000x |
Petri dish, 10 cm | Greiner | 633102 | |
Q5 buffer | New England Biolabs | B9027S | |
Q5 high-fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0491S | |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen | QE09050 | Store aliquots at -20 °C |
R-spondin 3 conditioned medium | U-Protein Express | Custom order | Store at -20 °C |
sgRNA Reverse Primer: TCTGCGCCCATCTGTTGCTT CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG | IDT | ||
Slides | StarFrost | MBB-0302-55A | Adhesive, ground |
Sodium azide | Merck | 8.22335.1000 | CAS: 26628-22-8, CAUTION |
Sodium cytrate dihydrate | J.T. Baker | 0280 | CAS: 6132-04-3 |
Standard Forward Primer: “/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG TTAAAATAAGGC |
IDT | ||
Subcloning efficiency competent cells DH5alpha | Invitrogen | 18265-017 | |
Suspension cell culture plates (24-well) | Greiner Bio-One | 662102 | 24-well |
Suspension cell culture plates (12-well) | Greiner Bio-One | 665102 | 12-well |
T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | |
TAE buffer | ThermoFisher Scientific | B49 | Stock at 50x, dilute to 1x with ultrapure water |
Transposase-containing plasmid | Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156 | ||
TrypLE Express Enzyme | Invitrogen | 12605-028 | store at 4 °C |
U6_Forward primer: GGGCAGGAAGAGGGCCTAT | IDT | ||
UltraPure Agarose 1000 | Invitrogen | 16550 | |
Water bath | Tulabo | ||
Xylene | Klinipath | 4055-9005 | CAS: 1330-20-7, CAUTION |
Y-27632 | Abmole Bioscience | Y-27632 dihydrochloride | Store at -20 °C, stock at 10 mM, 1000x |