수동 수분, 현미경 및 S-유전자형 분석을 사용한 감귤류의 자체 (in)호환성 및 inter-(in)compatibility 관계 결정
Summary
이 프로토콜은 감귤류 품종의 꽃가루 호환성과 비호환성을 결정하는 빠른 방법을 제공합니다.
Abstract
Citrus는 자가 꽃가루를 거부하기 위해 S-RNase 기반 자가 비호환성을 사용하므로 성공적인 수분 및 수정을 위해 근처의 수분 매개체 나무가 필요합니다. 그러나 수분 조절제 역할을 할 적절한 품종을 식별하는 것은 시간이 많이 걸리는 과정입니다. 이 문제를 해결하기 위해 우리는 아가로스 겔 전기 영동 및 아닐린 블루 염색을 활용하는 수분 호환 감귤 품종을 식별하는 신속한 방법을 개발했습니다. 꽃가루 적합성은 전체 DNA를 추출하고 특정 프라이머로 PCR 기반 유전형 분석을 수행하여 S 유전자형을 식별하여 결정됩니다. 또한, 수동 수분 후 3-4 일 후에 스타일을 수집하고 아닐린 블루 염색을 수행합니다. 마지막으로 꽃가루관의 성장 상태를 형광현미경으로 관찰합니다. 꽃가루 적합성과 비호환성은 꽃가루 튜브 성장이 각각 정상인지 억제되는지 관찰하여 확인할 수 있습니다. 단순성과 비용 효율성으로 인해이 방법은 서로 다른 감귤류 품종의 꽃가루 호환성과 비 호환성을 결정하여 서로 다른 품종 간의 비 호환성 그룹 및 비 호환성 관계를 설정하는 효과적인 도구입니다. 이 방법은 적합한 수분 매개체 나무를 성공적으로 선택하는 데 필수적인 정보를 제공하므로 새로운 과수원을 설립하고 육종 프로그램에 적합한 부모를 쉽게 선택할 수 있습니다.
Introduction
자기 비호환성(SI)은 속씨식물 종의 약 40%에 존재하는 유전적으로 제어되는 메커니즘입니다. 이 과정에서 암술은 동일한 SI 유전자형을 가진 식물의 꽃가루를 거부하여 자가 수정을 방지합니다 1,2. Ma jia pummelo는 중국 Jinagsu 지방의 지역 품종으로 크고 분홍색 과일, 풍부한 주스 함량, 새콤 달콤한 맛 및 두꺼운 껍질의 우수한 품질을 가지고 있습니다3. SI는 이종 교배를 촉진하지만, 과일의 수확량과 품질에 부정적인 영향을 미치며4 신뢰할 수 있는 과일 경화율과 높은 수확량을 위해 뚜렷한 SI 유전자형을 가진 적절한 수분 매개체 나무를 필요로 한다. 현재 SI에는 Brassicaceae로 대표되는 포자자기비적합성(SSI)과 장미과, 양귀비과, Rutaceae 및 Solanaceae로 대표되는 배우자생자부적합성(GSI)의 두 가지 주요 유형이 있습니다 5,6,7,8.
감귤류는 세계에서 가장 중요한 과일 작물 중 하나입니다. S-RNase 기반 GSI 시스템은 많은 감귤류 섭취에서 발견되며, 과실형성률에 부정적인 영향을 미친다9. 이 시스템에서, SI는 암술 S 결정인자와 꽃가루 S 결정인자를 운반하는 두 개의 복잡한 대립유전자를 갖는 단일 다형성 유전자 좌인 S 유전자좌에 의해 제어된다7. 여성 결정인자는 S 리보 뉴클레아제(S-RNase)이고 남성 결정인자는 S 유전자좌 F-box(SLF)7입니다. 암술의 세포는 S-RNase 단백질을 분비합니다. 비-자기 S-RNase는 SLF 단백질에 의해 인식되고, 이는 26S 프로테아좀 경로에 의한 비-자기 S-RNase의 유비퀴틴화 및 분해를 유도한다. 대조적으로, 자가 S-RNase는 SLF 단백질을 회피하기 때문에 꽃가루관(PT) 성장을 축적하고 억제할 수 있으며, 따라서 유비퀴틴화10,11,12,13을 방지할 수 있습니다.
여기에서 우리는 S-유전자형과 꽃가루 적합성 및 비적합성 정도를 식별하는 데 유용한 생체 내 기술을 보고합니다. 이 프로토콜은 잎에서 총 DNA를 추출하고 S 특이적 프라이머를 사용하여 S 유전자형을 예측하는 것을 포함합니다. 또한, 아닐린 블루 염색 및 형광 현미경 검사 후 손 수분은 호환성과 비호환성의 정도에 대한 증거를 제공합니다. 실험실14,15에서 꽃의 수동 수분을 포함하는 반 생체 내 수분 절차는 또한 자기 적합성 및 비 호환성의 정도를 평가하기 위해 조정되었습니다. 그러나 우리는 또한 꽃가루 튜브가 자연 조건에서 자랄 수 있도록 원치 않는 꽃가루로 인한 오염을 피하기 위해 꽃을 자루에 넣은 다음 밭 수분을 사용했습니다. 이 프로토콜은 간단하고 간단하며 적합한 수분 조절자 나무를 성공적으로 선택하는 데 필요한 정보를 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
과일 작물에서 parthenocarpy와 SI는 모두 씨없는 과일의 길을 열어주기 때문에 중요한 특성입니다. 자기 비 호환성은자가 꽃가루의 거부를 촉진하여 근친 교배를 예방합니다20. 감귤류 중에서, pummelo는 자기 양립 할 수없는 품종입니다7. 모든 속씨식물 종의 거의 40%가 SI21을 나타냅니다. 이 특성은 과일 세팅을 방지하고 수확량을 낮추며 재배자에?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로젝트는 중국 국립 자연 과학 재단 (32122075, 32072523)의 재정 지원을 받았습니다.
Materials
| absolute ethanol | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | |
| Aniline blue | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | ||
| Boric acid, H3BO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10004818 | |
| Brown bottle | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| Calcium nitrate tetrahydrate, Ca(NO3 )2 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 80029062 | |
| Centrifugal tube | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| centrifuge tubes | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| CTAB | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 57-09-0(CAS) | |
| Dropping | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009617 | |
| Forceps | LUXIANZI Biotechnology Co., Ltd | ||
| formaldehyde | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10010018 | |
| Fully automatic sample fast grinder | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | Tissuelyser-96 | |
| glacial acetic acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | |
| Grinding Tube | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | ||
| Isoamyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10003218 | |
| Isopropyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80109218 | |
| label | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| Leica DMi8 | Shanghai Leica Co.,Ltd | 21903797 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10013018 | |
| MICROSCOPE Cover glass | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019318 | |
| paper clips | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pencil | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pollinator brush | Shanghai Yimei Plastics Co., Ltd | ||
| Polyethylene glycol, PEG 6000 | Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd | DH229-1 | |
| Polyethylene glycol, PEG-4000 | Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd | 1521GR500 | |
| Potassium hydroxide, KOH | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017008 | |
| Potassium nitrate, KNO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017218 | |
| Scalpel | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Slide | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| Sodium hydroxide, NAOH | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019718 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10021418 | |
| sulfate paper | Taizhou Jinnong Mesh Factory | ||
| Thermostat water bath | Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd | L-909193 | |
| Trichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10006818 | |
| Tripotassium phosphate tribasic trihydrate, K3PO4 | Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co.,Ltd | 20032318 | |
| Tris-HCl | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 1185-53-1 | |
| zip lock bags | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| β-Mercaptoethanol | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 60-24-2(CAS) |
References
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