Bestimmung von Selbst(in)kompatibilitäts- und Inter(in)kompatibilitätsbeziehungen bei Zitrusfrüchten mittels manueller Bestäubung, Mikroskopie und S-Genotyp-Analysen
Summary
Dieses Protokoll bietet eine schnelle Methode zur Bestimmung der Pollenkompatibilität und -unverträglichkeit bei Zitrussorten.
Abstract
Zitrusfrüchte nutzen die S-RNase-basierte Selbstinkompatibilität, um Selbstpollen abzulehnen, und benötigen daher für eine erfolgreiche Bestäubung und Befruchtung in der Nähe von Bestäuberbäumen. Die Identifizierung geeigneter Sorten, die als Bestäuber dienen können, ist jedoch ein zeitaufwändiger Prozess. Um dieses Problem zu lösen, haben wir eine schnelle Methode zur Identifizierung bestäubungskompatibler Zitrussorten entwickelt, die Agarose-Gelelektrophorese und Anilinblaufärbung nutzt. Die Pollenkompatibilität wird auf der Grundlage der Identifizierung von S-Genotypen durch Extraktion der Gesamt-DNA und Durchführung von PCR-basierten Genotypisierungsassays mit spezifischen Primern bestimmt. Zusätzlich werden die Stile 3-4 Tage nach der manuellen Bestäubung gesammelt und eine Anilinblaufärbung durchgeführt. Abschließend wird der Wachstumszustand der Pollenschläuche mit einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Die Pollenkompatibilität und -inkompatibilität kann festgestellt werden, indem beobachtet wird, ob das Pollenschlauchwachstum normal bzw. unterdrückt ist. Aufgrund ihrer Einfachheit und Kosteneffizienz ist diese Methode ein effektives Werkzeug, um die Pollenkompatibilität und -inkompatibilität verschiedener Zitrussorten zu bestimmen, um Inkompatibilitätsgruppen und Inkompatibilitätsbeziehungen zwischen verschiedenen Sorten zu ermitteln. Diese Methode liefert Informationen, die für die erfolgreiche Auswahl geeigneter Bestäuberbäume unerlässlich sind, und erleichtert so die Anlage neuer Obstplantagen und die Auswahl geeigneter Eltern für Zuchtprogramme.
Introduction
Selbstinkompatibilität (SI) ist ein genetisch gesteuerter Mechanismus, der bei etwa 40 % der Angiospermenarten vorkommt. Dabei stößt der Stempel Pollen einer Pflanze mit gleichem SI-Genotyp ab und verhindert so die Selbstbefruchtung 1,2. Ma jia pummelo ist eine lokale Sorte in der Provinz Jinagsu, China, mit den hervorragenden Eigenschaften von großen, rosa Früchten, einem reichhaltigen Saftgehalt, einem süß-sauren Geschmack und einer dicken Schale3. Obwohl SI die Auskreuzung fördert, wirkt es sich negativ auf den Ertrag und die Qualität der Früchteaus 4 und erfordert geeignete Bestäuberbäume mit unterschiedlichen SI-Genotypen für zuverlässige Fruchtansatzraten und hohe Erträge. Gegenwärtig gibt es zwei Haupttypen von SI, die sporophytische Selbstinkompatibilität (SSI), die durch Brassicaceae repräsentiert wird, und die gametophytische Selbstinkompatibilität (GSI), die durch Rosaceae, Papaveraceae, Rutaceae und Solanaceae repräsentiert wird 5,6,7,8.
Zitrusfrüchte sind eine der wichtigsten Obstkulturen der Welt. Das S-RNase-basierte GSI-System findet sich in vielen Zitrusakzessionen und beeinflusst die Fruchtansatzrate negativ9. In diesem System wird SI durch den S-Locus kontrolliert, einen einzelnen polymorphen Locus mit zwei komplexen Allelen, die Stempel-S-Determinanten und Pollen-S-Determinanten 7 tragen. Die weibliche Determinante ist die S-Ribonuklease (S-RNase) und die männliche Determinante ist die S-Locus-F-Box (SLF)7. Die Zellen des Stempels sezernieren S-RNase-Proteine. Die non-self S-RNasen werden von den SLF-Proteinen erkannt, was zur Ubiquitinierung und zum Abbau der non-self S-RNasen durch den 26S Proteasomweg führt. Im Gegensatz dazu sind die eigenen S-RNasen in der Lage, das Pollenschlauchwachstum (PT) zu akkumulieren und zu hemmen, da sie den SLF-Proteinen ausweichen und daher an der Ubiquitinierung gehindert werden10,11,12,13.
Hier berichten wir über eine In-vivo-Technik, die für die Identifizierung von S-Genotypen und den Grad der Pollenkompatibilität und -inkompatibilität nützlich ist. Das Protokoll umfasst die Extraktion der Gesamt-DNA aus Blättern und die Vorhersage des S-Genotyps mithilfe von S-spezifischen Primern. Darüber hinaus liefern Anilinblaufärbung und Fluoreszenzmikroskopie mit anschließender Handbestäubung Hinweise auf den Grad der Verträglichkeit und Inkompatibilität. Das Semi-in-vivo-Bestäubungsverfahren, bei dem Blüten im Labor manuell bestäubt werden14,15, wurde ebenfalls angepasst, um den Grad der Selbstverträglichkeit und Inkompatibilität zu beurteilen. Wir haben jedoch auch eine Feldbestäubung mit anschließendem Einsacken von Blüten verwendet, um eine Kontamination durch unerwünschte Pollen zu vermeiden, damit sich die Pollenschläuche unter natürlichen Bedingungen entwickeln können. Dieses Protokoll ist einfach und unkompliziert und liefert die Informationen, die für die erfolgreiche Auswahl geeigneter Bestäuberbäume erforderlich sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
In Obstkulturen sind sowohl Parthenokarpie als auch SI wichtige Merkmale, da sie den Weg für kernlose Früchte ebnen – eine Eigenschaft, die von den Verbrauchern sehr geschätzt wird. Die Selbstinkompatibilität fördert die Abstoßung von Selbstpollen und beugt so Inzucht vor20. Unter den Zitrusfrüchten ist Pummelo eine selbstunverträgliche Sorte7. Fast 40% aller Angiospermenarten weisen SI21 auf. Diese Eigenschaft verhindert den Fruchtansatz, se…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Projekt wurde von der National Natural Science Foundation of China (32122075, 32072523) finanziell unterstützt.
Materials
| absolute ethanol | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | |
| Aniline blue | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | ||
| Boric acid, H3BO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10004818 | |
| Brown bottle | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| Calcium nitrate tetrahydrate, Ca(NO3 )2 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 80029062 | |
| Centrifugal tube | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| centrifuge tubes | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| CTAB | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 57-09-0(CAS) | |
| Dropping | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009617 | |
| Forceps | LUXIANZI Biotechnology Co., Ltd | ||
| formaldehyde | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10010018 | |
| Fully automatic sample fast grinder | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | Tissuelyser-96 | |
| glacial acetic acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | |
| Grinding Tube | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | ||
| Isoamyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10003218 | |
| Isopropyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80109218 | |
| label | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| Leica DMi8 | Shanghai Leica Co.,Ltd | 21903797 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10013018 | |
| MICROSCOPE Cover glass | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019318 | |
| paper clips | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pencil | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pollinator brush | Shanghai Yimei Plastics Co., Ltd | ||
| Polyethylene glycol, PEG 6000 | Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd | DH229-1 | |
| Polyethylene glycol, PEG-4000 | Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd | 1521GR500 | |
| Potassium hydroxide, KOH | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017008 | |
| Potassium nitrate, KNO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017218 | |
| Scalpel | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Slide | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| Sodium hydroxide, NAOH | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019718 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10021418 | |
| sulfate paper | Taizhou Jinnong Mesh Factory | ||
| Thermostat water bath | Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd | L-909193 | |
| Trichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10006818 | |
| Tripotassium phosphate tribasic trihydrate, K3PO4 | Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co.,Ltd | 20032318 | |
| Tris-HCl | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 1185-53-1 | |
| zip lock bags | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| β-Mercaptoethanol | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 60-24-2(CAS) |
References
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