تحديد التوافق الذاتي (عدم) والعلاقات بين (عدم) التوافق في الحمضيات باستخدام التلقيح اليدوي والفحص المجهري وتحليلات النمط الجيني S
Summary
يوفر هذا البروتوكول طريقة سريعة لتحديد توافق حبوب اللقاح وعدم التوافق في أصناف الحمضيات.
Abstract
تستخدم الحمضيات عدم التوافق الذاتي القائم على S-RNase لرفض حبوب اللقاح الذاتية ، وبالتالي تتطلب أشجار الملقحات القريبة للتلقيح والتسميد الناجحين. ومع ذلك ، فإن تحديد الأصناف المناسبة لتكون بمثابة ملقحات عملية تستغرق وقتا طويلا. لحل هذه المشكلة ، قمنا بتطوير طريقة سريعة لتحديد أصناف الحمضيات المتوافقة مع التلقيح والتي تستخدم الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز وتلطيخ الأنيلين الأزرق. يتم تحديد توافق حبوب اللقاح بناء على تحديد الأنماط الجينية S عن طريق استخراج الحمض النووي الكلي وإجراء فحوصات التنميط الجيني القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام مواد أولية محددة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم جمع الأنماط بعد 3-4 أيام من التلقيح اليدوي ، ويتم إجراء تلطيخ أزرق الأنيلين. أخيرا ، يتم ملاحظة حالة نمو أنابيب حبوب اللقاح باستخدام مجهر مضان. يمكن إثبات توافق حبوب اللقاح وعدم توافقها من خلال ملاحظة ما إذا كان نمو أنبوب حبوب اللقاح طبيعيا أم مكبوتا ، على التوالي. نظرا لبساطتها وفعاليتها من حيث التكلفة ، تعد هذه الطريقة أداة فعالة لتحديد توافق حبوب اللقاح وعدم توافق أصناف الحمضيات المختلفة لإنشاء مجموعات عدم التوافق وعلاقات عدم التوافق بين الأصناف المختلفة. توفر هذه الطريقة معلومات أساسية للاختيار الناجح لأشجار الملقحات المناسبة ، وبالتالي تسهل إنشاء بساتين جديدة واختيار الآباء المناسبين لبرامج التربية.
Introduction
عدم التوافق الذاتي (SI) هو آلية يتم التحكم فيها وراثيا موجودة في حوالي 40٪ من أنواع كاسيات البذور. في هذه العملية ، ترفض المدقة حبوب اللقاح من نبات له نفس النمط الوراثي SI ، وبالتالي تمنع الإخصاب الذاتي 1,2. Ma jia pummelo هو نوع محلي في مقاطعة Jinagsu ، الصين ، مع الصفات الممتازة للفاكهة الوردية الكبيرة ، ومحتوى العصير الغني ، والطعم الحلو والحامض ، وقشر سميك3. على الرغم من أن SI يعزز التهجين ، إلا أنه يؤثر سلبا على محصول وجودة الثمار4 ويتطلب أشجار ملقحات مناسبة ذات أنماط وراثية مميزة من SI للحصول على معدلات موثوقة لتحديد الفاكهة وإنتاجية عالية. في الوقت الحاضر ، هناك نوعان رئيسيان من SI ، عدم التوافق الذاتي البوغي (SSI) ، ويمثله Brassicaceae ، وعدم التوافق الذاتي المشيجي (GSI) ، ويمثله Rosaceae و Papaveraceae و Rutaceae و Solanaceae5،6،7،8.
الحمضيات هي واحدة من أهم محاصيل الفاكهة في العالم. تم العثور على نظام GSI القائم على S-RNase في العديد من مدخلات الحمضيات ويؤثر سلبا على معدل تكوين الفاكهة9. في هذا النظام ، يتم التحكم في SI بواسطة موضع S ، وهو موضع واحد متعدد الأشكال مع أليلين معقدين يحملان محددات المدقة S ومحددات حبوب اللقاحS 7. المحدد الأنثوي هو S ribonuclease (S-RNase) ، والمحدد الذكري هو S locus F-box (SLF) 7. تفرز خلايا المدقة بروتينات S-RNase. يتم التعرف على S-RNases غير الذاتية بواسطة بروتينات SLF ، مما يؤدي إلى انتشار وتدهور S-RNases غير الذاتي بواسطة مسار البروتيازوم 26S. في المقابل ، فإن S-RNases الذاتية قادرة على تجميع وتثبيط نمو أنبوب حبوب اللقاح (PT) لأنها تتهرب من بروتينات SLF ، وبالتالي ، يتم منعها من الانتشار في كل مكان10،11،12،13.
هنا ، نبلغ عن تقنية في الجسم الحي مفيدة لتحديد الأنماط الجينية S ودرجات توافق حبوب اللقاح وعدم توافقها. يتضمن البروتوكول استخراج الحمض النووي الكلي من الأوراق والتنبؤ بالنمط الجيني S باستخدام الاشعال الخاصة ب S. علاوة على ذلك ، يوفر تلطيخ الأنيلين الأزرق والفحص المجهري الفلوري متبوعا بالتلقيح اليدوي دليلا على درجة التوافق وعدم التوافق. كما تم تكييف إجراء التلقيح شبه في الجسم الحي ، والذي يتضمن التلقيح اليدوي للزهور في المختبر14,15 ، لتقييم درجات التوافق الذاتي وعدم التوافق. ومع ذلك ، فقد استخدمنا أيضا التلقيح الميداني متبوعا بتعبئة الزهور لتجنب التلوث من حبوب اللقاح غير المرغوب فيها للسماح لأنابيب حبوب اللقاح بالتطور في الظروف الطبيعية. هذا البروتوكول بسيط ومباشر ويوفر المعلومات اللازمة للاختيار الناجح لأشجار الملقحات المناسبة.
Protocol
Representative Results
Discussion
في محاصيل الفاكهة ، يعتبر كل من البارثينوكاربي و SI من السمات المهمة لأنهما يمهدان الطريق للفواكه الخالية من البذور – وهي سمة تحظى بتقدير كبير من قبل المستهلكين. عدم التوافق الذاتي يعزز رفض حبوب اللقاح الذاتية ، وبالتالي يمنع زواج الأقارب20. بين الحمضيات ، pummelo هو نوع غير متوافق …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا المشروع ماليا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32122075 ، 32072523).
Materials
| absolute ethanol | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | |
| Aniline blue | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | ||
| Boric acid, H3BO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10004818 | |
| Brown bottle | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| Calcium nitrate tetrahydrate, Ca(NO3 )2 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 80029062 | |
| Centrifugal tube | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| centrifuge tubes | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| CTAB | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 57-09-0(CAS) | |
| Dropping | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009617 | |
| Forceps | LUXIANZI Biotechnology Co., Ltd | ||
| formaldehyde | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10010018 | |
| Fully automatic sample fast grinder | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | Tissuelyser-96 | |
| glacial acetic acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | |
| Grinding Tube | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | ||
| Isoamyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10003218 | |
| Isopropyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80109218 | |
| label | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| Leica DMi8 | Shanghai Leica Co.,Ltd | 21903797 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10013018 | |
| MICROSCOPE Cover glass | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019318 | |
| paper clips | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pencil | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pollinator brush | Shanghai Yimei Plastics Co., Ltd | ||
| Polyethylene glycol, PEG 6000 | Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd | DH229-1 | |
| Polyethylene glycol, PEG-4000 | Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd | 1521GR500 | |
| Potassium hydroxide, KOH | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017008 | |
| Potassium nitrate, KNO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017218 | |
| Scalpel | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Slide | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| Sodium hydroxide, NAOH | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019718 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10021418 | |
| sulfate paper | Taizhou Jinnong Mesh Factory | ||
| Thermostat water bath | Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd | L-909193 | |
| Trichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10006818 | |
| Tripotassium phosphate tribasic trihydrate, K3PO4 | Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co.,Ltd | 20032318 | |
| Tris-HCl | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 1185-53-1 | |
| zip lock bags | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| β-Mercaptoethanol | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 60-24-2(CAS) |
References
- Matsumoto, D., Tao, R. Recognition of S-RNases by an S locus F-box like protein and an S haplotype-specific F-box like protein in the Prunus-specific self-incompatibility system. Plant Molecular Biology. 100 (4-5), 367-378 (2019).
- Goldberg, E. E., et al. Species selection maintains self-incompatibility. Science. 330 (6003), 493-495 (2010).
- Zhang, L., Wang, R., Zhao, G., Wang, A., Lin, G. Comparative study on fruit quality of Guangfeng Ma jia pummelo and Pinghe red pummelo. China Agricultural Science Bulletin. 37 (22), 126-130 (2021).
- Min, H. E., Chao, G. U., Juyou, W. U., Shaoling, Z. Recent advances on self-incompatibility mechanism in fruit trees. Acta Horticulturae Sinica. 48 (4), 759-777 (2021).
- Fujii, S., Kubo, K., Takayama, S. Non-self- and self-recognition models in plant self-incompatibility. Nature Plants. 2 (9), 2-9 (2016).
- Meng, X., Sun, P., Kao, T. S-RNase-based self-incompatibility in Petunia inflata. Annals of Botany. 108 (4), 637-646 (2011).
- Liang, M., et al. Evolution of self-compatibility by a mutant Sm-RNase in citrus. Nature Plants. 6 (2), 131-142 (2020).
- Thomas, S. G., Franklin-Tong, V. E. Self-incompatibility triggers programmed cell death in Papaver pollen. Nature. 429, 305-309 (2004).
- Hu, J., et al. Downregulated expression of S2-RNase attenuates self-incompatibility in "Guiyou No. 1" pummelo. Horticulture Research. 8 (1), 199 (2021).
- Guo, H., Halitschke, R., Wielsch, N., Gase, K., Baldwin, I. T. Mate selection in self-compatible wild tobacco results from coordinated variation in homologous self-Incompatibility genes. Current Biology. 29 (12), 2020-2030 (2019).
- Sun, P., Li, S., Lu, D., Williams, J. S., Kao, T. Pollen S-locus F-box proteins of petunia involved in S-RNase-based self-incompatibility are themselves subject to ubiquitin-mediated degradation. The Plant Journal. 83 (2), 213-223 (2015).
- Hua, Z., Kao, T. Identification and characterization of components of a putative petunia S-locus F-box-containing E3 ligase complex involved in S-RNase-based self-incompatibility. Plant Cell. 18 (10), 2531-2553 (2006).
- Entani, T., et al. Ubiquitin-proteasome-mediated degradation of S-RNase in a solanaceous cross-compatibility reaction. The Plant Journal. 78 (6), 1014-1021 (2014).
- Abdallah, D. Analysis of self-incompatibility and genetic diversity in diploid and hexaploid plum genotypes. Frontiers in Plant Science. 10, 896 (2019).
- Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. Optimizing production in the new generation of apricot cultivars: self-incompatibility, S-RNase allele identification, and incompatibility group assignment. . Frontiers in Plant Science. 9, 527 (2018).
- Yuan, S. C., Chin, S. W., Lee, C. Y., Chen, F. C. Phalaenopsis pollinia storage at sub-zero temperature and its pollen viability assessment. Botanical Studies. 59 (1), 1 (2018).
- Liang, M. Identification and evolution of genes related to self-incompatibility in citrus. , (2019).
- Cheng, Y. J., Guo, W. W., Yi, H. L., Pang, X. M., Deng, X. X. An efficient protocol for genomic DNA extraction from Citrus species. Plant Molecular Biology Reporter. 21 (2), 177-178 (2003).
- Wei, Z., et al. Identification of S-genotypes of 63 pummelo germplasm resources. Acta Horticulturae Sinica. 49 (5), 1111-1120 (2021).
- de Nettancourt, D. Incompatibility in angiosperms. Sexual Plant Reproduction. 10, 185-199 (1997).
- Igic, B., Lande, R., Kohn, J. R. Loss of self-incompatibility and its evolutionary consequences. International Journal of Plant Sciences. 169 (1), 93-104 (2008).
- Guerrero, B. I., Guerra, M. E., Rodrigo, J. Establishing pollination requirements in Japanese plum by phenological monitoring, hand pollinations, fluorescence microscopy and molecular genotyping. Journal of Visualized Experiments. (165), e61897 (2020).
- Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses. Journal of Visualized Experiments. (160), e60241 (2020).
