スキムミルク凝集と限外ろ過を用いた環境水および廃水サンプルからのウイルス粒子の濃縮
Summary
環境水および廃水サンプルからのウイルス濃度は困難な作業であり、主にウイルスの同定と定量のために実行されます。いくつかのウイルス濃縮法が開発およびテストされていますが、ここでは、異なるサンプルタイプのRNAウイルスに対する限外ろ過と脱脂粉乳凝集の有効性を示します。
Abstract
水と廃水に基づく疫学は、コミュニティでの発生の経過を監視および予測するための代替方法として浮上しています。廃水や環境水サンプルからウイルス、バクテリア、微小真核生物などの微生物画分を回収することは、これらのアプローチにおける困難なステップの1つです。本研究では、他の研究でも対照として使用されているArmorRNAを試験ウイルスとして使用した逐次限外ろ過および脱脂粉乳凝集(SMF)法の回収効率に着目しました。限外ろ過装置の目詰まりを防ぐために、限外ろ過の前に固体粒子を除去するために、0.45μmおよび0.2μmのメンブレンディスクフィルターによる事前ろ過が適用されました。逐次限外ろ過法で処理された試験サンプルを、2つの異なる速度で遠心分離した。速度を上げると、アーマードRNAの回復率と陽性率が低下しました。一方、SMFは、アーマードRNAの比較的一貫した回収率と陽性率をもたらしました。環境水サンプルを用いて実施された追加の試験は、他の微生物画分を濃縮するためのSMFの有用性を実証した。ウイルスの固体粒子への分割は、廃水サンプルの限外ろ過の前に適用される事前ろ過ステップを考慮すると、全体的な回収率に影響を与える可能性があります。プレフィルトレーション付きSMFは、サンプル中の固形分濃度が低く、固形物への分配率が低いため、環境水サンプルに適用すると優れた性能を発揮しました。本研究では、逐次限外ろ過法を使用するというアイデアは、一般的に使用される限外ろ過装置の供給が限られていたCOVID-19パンデミック時にウイルス濃縮物の最終量を減らす必要性から生じ、代替のウイルス濃縮法の開発が必要でした。
Introduction
微生物群集分析および疫学研究のために、地表および廃水サンプル中の微生物の有効濃度を決定することは、群集における発生の経過を監視および予測するための重要なステップの1つです1,2。COVID-19のパンデミックは、濃縮方法を改善することの重要性を明らかにしました。COVID-19は2019年後半に出現し、2023年3月の時点で、依然として人間の健康、社会生活、および経済に脅威を与えています。ウイルスの急速な感染と拡散に加えて、COVID-19の新しい波と亜種、および報告されていない無症候性の症例が出現しているため、コミュニティでのCOVID-19の発生の影響を軽減するための効果的な監視および管理戦略が重要な研究トピックになっています3,4,5.市民社会組織、政府機関、および公的または民間の公益事業によるCOVID-19の廃水ベースの疫学の使用は、迅速な発生関連情報を提供し、COVID-19の発生の影響を軽減するのに役立ちました6,7,8,9。しかし、廃水サンプル中のエンベロープRNAウイルスであるSARS-CoV-2の濃度は、依然として課題10を提起しています。たとえば、これらの課題の1つは、廃水固形物中のSARS-CoV-2の分配であり、濃縮11中に固形物が除去されると、回収に影響を与える可能性があります。この場合、定量/評価の焦点は、水相のみではなく、環境水サンプルの固相と水相の両方にある必要があります。さらに、濃縮方法の選択は、下流の試験および分析に基づいて変更することができる。環境サンプルからのウイルス粒子と病原体の濃度は、シーケンシングとマイクロバイオーム分野の発展に伴い、緊急の研究トピックになっています。
環境水や廃水サンプルからのウイルス濃縮の分野では、さまざまなウイルス濃縮法が適用されています。一般的に使用される方法には、ろ過、スキムミルク凝集(SMF)、吸着/溶出、およびポリエチレングリコール沈殿があります12〜17。その中で、SMFは安価で効果的な方法と見なされており、テストに成功し、廃水や地表水からSARS-CoV-2などのウイルスを回収するために適用されています12,15,16,18。SMF法は比較的新しいアプローチであり、汚泥、生下水、廃水、排水サンプルなど、あらゆる種類の水サンプルからウイルス、細菌、原生動物などの幅広い微生物を同時に回収するための適切な方法論として、多くの環境研究で認識が高まっています19.限外ろ過やグリシンアルカリ溶出、凍結乾燥ベースのアプローチ、超遠心やグリシンアルカリ溶出など、環境サンプルからウイルスを回収する他の既知の方法論と比較すると、SMFはウイルスの回収率と検出率が高い最も効率的な方法として報告されています18,20.本研究では、SARS-CoV-2回収を評価するための試験を含むウイルス濃縮法の回収効率を評価するために、ArmedRNAを試験ウイルスとして使用しました21,22。
ここでは、廃水と環境水のサンプルをテストして、SMFの有用性と、定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)、シーケンスベースのメタゲノミクス、およびディープアンプリコンシーケンシングのために微生物画分を濃縮するためのシーケンシャル限外ろ過法を実証しました。SMFは比較的安価な方法であり、限外ろ過法と比較して大量のサンプルに最適です。シーケンシャル限外ろ過法を使用するというアイデアは、一般的に使用される限外ろ過装置の供給が制限されていたCOVID-19パンデミック時にウイルス濃縮物の最終量を減らす必要性から生じ、代替のウイルス濃縮法の開発が必要でした。
Protocol
Representative Results
Discussion
この研究の重要なステップの1つは、0.2 μmおよび0.45 μmのメンブレンフィルターを使用した事前ろ過ステップを適用することによる固体粒子の除去です。ウイルスの固体粒子、特にエンベロープウイルスへの分割を考慮すると、事前ろ過はウイルス回収の著しい損失を引き起こす可能性があります30。限外ろ過装置の目詰まりを防ぐために、環境サンプルや廃水サンプルには?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、NSERCアライアンスCovid-19助成金(賞番号431401363、2020-2021、ユアン博士とウヤグアリディアス博士)によってサポートされました。MUDは、大学研究助成プログラム(賞番号325201)に感謝します。JFとJZAはどちらも、視覚および自動疾病分析(VADA)大学院トレーニングプログラムによってサポートされています。KYとJFはどちらも、Mitacs Accelerate プログラムからフェローシップを受け取りました。MUDと彼の研究室のメンバー(KY、JF、JZA)は、NSERC-DG(RGPIN-2022-04508)および研究マニトバ新任研究者運営助成金(No 5385)によってサポートされています。マニトバ州ウィニペグ市に感謝します。この研究はマニトバ大学で行われました。マニトバ大学のキャンパスは、アニシナアベグ、クリー、オジクリー、ダコタ、ディネの人々の元の土地と、メティスネーションの故郷にあることを認めたいと思います。
Materials
| 0.2 M sodium phosphate buffer with a pH 7.5 | Alfa Aesar | J62041AP | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| 0.2 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters | VWR | 66234 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| 0.45 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters | VWR | 60043 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| 4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444432 | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA |
| Armored RNA Quant IPC-1 Processing Control | Asuragen | 49650 | Asuragen, Austin, TX, USA |
| Brand A, Jumbosep Centrifugal Device, 30-kDa | Pall | OD030C65 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Brand B, Microsep Advance Centrifugal Device, 30-kDa | Pall | MCP010C46 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Centrifuge tubes (50 ml) | Nalgene | 3119-0050PK | Thermo Fisher Scientific |
| DNAse I | Invitrogen | 18047019 | Thermo Fisher Scientific |
| Dyna Mag-2 | Invitrogen | 12027 | Thermo Fisher Scientific |
| GWV High Capacity Groundwater Sampling Capsules – 0.45 µm | Pall | 12179 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Hydrochloric acid, 1N standard solution | Thermo Fisher Scientific | AC124210025 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit | Applied biosystems | A42358 | Thermo Fisher Scientific |
| Nuclease free water | Promega | P1197 | Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA |
| Peristaltic pump | Masterflex, Cole-Parmer instrument | 7553-20 | Thermo Fisher Scientific |
| pH meter | Denver instrument | RK-59503-25 | Cole-Parmer. This product has been discontinued |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 | Invitrogen | 15593031 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| Primers and probe sets | IDT | Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA | |
| Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kit | Qiagen | Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | A34322 | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA |
| Qubit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) assay kit | Invitrogen | Q33231 | Thermo Fisher Scientific |
| Qubit 4 Fluorometer, with WiFi | Invitrogen | Q33238 | Thermo Fisher Scientific |
| Qubit RNA High Sensitivity (HS) assay kit | Invitrogen | Q32855 | Thermo Fisher Scientific |
| RNAse A | Invitrogen | EN0531 | Thermo Fisher Scientific |
| RNeasy PowerMicrobiome Kit | Qiagen | 26000-50 | Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA |
| Skim milk powder | Difco (BD Life Sciences) | DF0032173 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| Sodium phosphate buffer | Alfa Aesar | Alfa Aesar, Ottawa, ON, Canada | |
| Synthetic seawater | VWR | RC8363-1 | RICCA chemical company |
| Synthetic single-stranded DNA gBlock | IDT | Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA | |
| VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices – 0.1 µm, 90 mm, gamma-irradiated | Pall | 4621 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices – 0.2 µm, 90 mm, gamma-irradiated | Pall | 4622 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
References
- Kumblathan, T., Liu, Y., Uppal, G. K., Hrudey, S. E., Lix, X. F. Wastewater-based epidemiology for community monitoring of SARS-CoV-2: progress and challenges. ACS Environmental Au. 1, 18-31 (2021).
- Lu, D., Huang, Z., Luo, J., Zhang, X., Sha, S. Primary concentration-The critical step in implementing the wastewater based epidemiology for the COVID-19 pandemic: A mini-review. The Science of The Total Environment. 747, 141245 (2020).
- Bi, Q. Insights into household transmission of SARS-CoV-2 from a population-based serological survey. Nature Communications. 12, 3643 (2021).
- Day, M. Covid-19: identifying and isolating asymptomatic people helped eliminate virus in Italian village. British Medical Journal. 368, 1165 (2020).
- Ing, A. J., Cocks, C., Green, J. P. COVID-19: in the footsteps of Ernest Shackleton. Thorax. 75 (8), 693-694 (2020).
- Bivins, A., et al. Wastewater-based epidemiology: global collaborative to maximize contributions in the fight against COVID-19. Environmental Science & Technology. 54 (13), 7754-7757 (2020).
- Medema, G., Heijnen, L., Elsinga, G., Italiaander, R., Brouwer, A. Presence of SARS-Coronavirus-2 RNA in sewage and correlation with reported COVID-19 prevalence in the early stage of the epidemic in the Netherlands. Environmental Science & Technology Letters. 7 (7), 511-516 (2020).
- Thompson, J. R., et al. Making waves: Wastewater surveillance of SARS-CoV-2 for population-based health management. Water Research. 184, 116181 (2020).
- Wu, F., et al. SARS-CoV-2 RNA concentrations in wastewater foreshadow dynamics and clinical presentation of new COVID-19 cases. The Science of the Total Environment. 805, 150121 (2022).
- Kantor, R. S., Nelson, K. L., Greenwald, H. D., Kennedy, L. C. Challenges in measuring the recovery of SARS-CoV-2 from wastewater. Environmental Science & Technology. 55 (6), 3514-3519 (2021).
- Chik, A. H. S., et al. Comparison of approaches to quantify SARS-CoV-2 in wastewater using RT-qPCR: Results and implications from a collaborative inter-laboratory study in Canada. Journal of Environmental Sciences. 107, 218-229 (2021).
- Hjelmsø, M. H., et al. Evaluation of methods for the concentration and extraction of viruses from sewage in the context of metagenomic sequencing. PLoS One. 12 (1), e0170199 (2017).
- Philo, S. E., et al. A comparison of SARS-CoV-2 wastewater concentration methods for environmental surveillance. The Science of the Total Environment. 760, 144215 (2021).
- Ahmed, W., Harwood, V. J., Gyawali, P., Sidhu, J. P. S., Toze, S. Comparison of concentration methods for quantitative detection of sewage-associated viral markers in environmental waters. Applied and Environmental Microbiology. 81 (6), 2042-2049 (2015).
- Calgua, B., et al. Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas. Water Research. 47 (8), 2797-2810 (2013).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Cashdollar, J. L., Wymer, L. Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies. Journal of Applied Microbiology. 115 (1), 1-11 (2013).
- Calgua, B., et al. New methods for the concentration of viruses from urban sewage using quantitative PCR. Journal of Virological Methods. 187 (2), 215-221 (2013).
- Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
- Assis, A. S. F., et al. Optimization of the skimmed-milk flocculation method for recovery of adenovirus from sludge. The Science of the Total Environment. 583, 163-168 (2017).
- Goncharova, E. A., et al. One-step quantitative RT-PCR assay with armored RNA controls for detection of SARS-CoV-2. Journal of Medical Virology. 93 (3), 1694-1701 (2021).
- Yu, X. F., et al. Preparation of armored RNA as a control for multiplex real-time reverse transcription-PCR detection of influenza virus and severe acute respiratory syndrome coronavirus. Journal of Clinical Microbiology. 46 (3), 837-841 (2008).
- Alygizakis, N., et al. Analytical methodologies for the detection of SARS-CoV-2 in wastewater: Protocols and future perspectives. Trends in Analytical Chemistry. 134, 116125 (2021).
- Garcia, A., et al. Quantification of human enteric viruses as alternative indicators of fecal pollution to evaluate wastewater treatment processes. PeerJ. 10, e12957 (2022).
- Gonzalez, R., et al. COVID-19 surveillance in Southeastern Virginia using wastewater-based epidemiology. Water Research. 186, 116296 (2020).
- Hietala, S. K., Crossley, B. M. Armored RNA as virus surrogate in a real-time reverse transcriptase PCR assay proficiency panel. Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 67-70 (2006).
- Uyaguari-Diaz, M. I., et al. A comprehensive method for amplicon-based and metagenomic characterization of viruses, bacteria, and eukaryotes in freshwater samples. Microbiome. 4 (1), 20 (2016).
- Meena, G. S., Singh, A. K., Gupta, V. K., Borad, S., Parmar, P. T. Effect of change in pH of skim milk and ultrafiltered/diafiltered retentates on milk protein concentrate (MPC70) powder properties. Journal of Food Science and Technology. 55 (9), 3526-3537 (2018).
- . Geneious Available from: https://www.geneious.com (2021)
- Ye, Y., Ellenberg, R. M., Graham, K. E., Wigginton, K. R. Survivability, partitioning, and recovery of enveloped viruses in untreated municipal wastewater. Environmental Science & Technology. 50 (10), 5077-5085 (2016).
- Philo, S. E., et al. Development and validation of the skimmed milk pellet extraction protocol for SARS-CoV-2 wastewater surveillance. Food and Environmental Virology. 14 (4), 355-363 (2022).
- Monteiro, S., et al. Recovery of SARS-CoV-2 from large volumes of raw wastewater is enhanced with the inuvai R180 system. Journalof Environmental Management. 304, 114296 (2022).
- Yanaç, K., Adegoke, A., Wang, L., Uyaguari, M., Yuan, Q. Detection of SARS-CoV-2 RNA throughout wastewater treatment plants and a modeling approach to understand COVID-19 infection dynamics in Winnipeg, Canada. The Science of The Total Environment. 825, 153906 (2022).
