Konsentrasjon av viruspartikler fra vann- og avløpsvannprøver i omgivelsene ved bruk av skummetmelkflokkulering og ultrafiltrering

Summary

Viruskonsentrasjon fra miljøvann- og avløpsvannprøver er en utfordrende oppgave, utført primært for identifisering og kvantifisering av virus. Mens flere viruskonsentrasjonsmetoder er utviklet og testet, demonstrerer vi her effektiviteten av ultrafiltrering og skummetmelkflokkulering for RNA-virus med forskjellige prøvetyper.

Abstract

Vann- og avløpsbasert epidemiologi har dukket opp som alternative metoder for å overvåke og forutsi forløpet av utbrudd i lokalsamfunn. Gjenoppretting av mikrobielle fraksjoner, inkludert virus, bakterier og mikroeukaryoter fra avløpsvann og miljøvannprøver, er et av de utfordrende trinnene i disse tilnærmingene. I denne studien fokuserte vi på utvinningseffektiviteten av sekvensiell ultrafiltrering og skummet melkflokkulering (SMF) metoder ved bruk av pansret RNA som testvirus, som også brukes som kontroll av noen andre studier. Forfiltrering med 0,45 μm og 0,2 μm membranskivefiltre ble påført for å eliminere faste partikler før ultrafiltrering for å forhindre tilstopping av ultrafiltreringsenheter. Testprøver, behandlet med sekvensiell ultrafiltreringsmetode, ble sentrifugert med to forskjellige hastigheter. En økt hastighet resulterte i lavere utvinning og positivitetsrater av pansret RNA. På den annen side resulterte SMF i relativt konsistent utvinning og positivitetsrater av pansret RNA. Ytterligere tester utført med miljøvannprøver demonstrerte nytten av SMF for å konsentrere andre mikrobielle fraksjoner. Oppdeling av virus i faste partikler kan ha innvirkning på den totale utvinningsgraden, med tanke på forfiltreringstrinnet som ble brukt før ultrafiltrering av avløpsvannprøver. SMF med forfiltrering presterte bedre når den ble brukt på miljøvannprøver på grunn av lavere faste konsentrasjoner i prøvene og dermed lavere partisjoneringshastighet til faste stoffer. I denne studien oppsto ideen om å bruke en sekvensiell ultrafiltreringsmetode fra nødvendigheten av å redusere det endelige volumet av viruskonsentratene under COVID-19-pandemien, da tilførselen av de vanlige ultrafiltreringsenhetene var begrenset, og det var behov for utvikling av alternative virale konsentrasjonsmetoder.

Introduction

Bestemmelse av effektiv konsentrasjon av mikroorganismer i overflate- og avløpsvannprøver for mikrobiell samfunnsanalyse og epidemiologiske studier, er et av de viktige trinnene for å overvåke og forutsi utbruddsforløpet i samfunn ^1,2. COVID-19-pandemien utfoldet viktigheten av å forbedre konsentrasjonsmetodene. COVID-19 dukket opp i slutten av 2019 og utgjør fra mars 2023 fortsatt en trussel mot menneskers helse, sosiale liv og økonomien. Effektive overvåkings- og kontrollstrategier for å lindre virkningene av COVID-19-utbrudd i lokalsamfunn har blitt et viktig forskningstema, ettersom nye bølger og varianter av COVID-19 har dukket opp i tillegg til den raske overføringen og spredningen av viruset, samt urapporterte og udiagnostiserte asymptomatiske tilfeller ^3,4,5. Bruken av avløpsvannbasert epidemiologi for COVID-19 av sivilsamfunnsorganisasjoner, offentlige etater og offentlige eller private verktøy har vært nyttig for å gi rask utbruddsrelatert informasjon og redusere virkningen av COVID-19-utbrudd 6,7,8,9. Konsentrasjonen av SARS-CoV-2, et innkapslet RNA-virus, i avløpsvannprøver gir imidlertid fortsatt utfordringer¹⁰. For eksempel er en av disse utfordringene partisjonering av SARS-CoV-2 i faste stoffer i avløpsvann, noe som kan påvirke utvinningen når de faste stoffene elimineres under konsentrasjon¹¹. Hvis dette er tilfelle, bør fokus for kvantifisering / vurdering være på både faste og vandige faser av miljøvannprøver, i stedet for bare den vandige fasen. Videre kan valg av konsentrasjonsmetode modifiseres basert på nedstrømstester og analyser. Konsentrasjonen av viruspartikler og patogener fra miljøprøver har blitt et presserende forskningstema med utviklingen innen sekvensering og mikrobiomfelt.

Ulike viruskonsentrasjonsmetoder har blitt brukt innen viruskonsentrasjon fra miljøvann og avløpsvannprøver. Noen vanlige metoder er filtrering, skummet melkeflokkulering (SMF), adsorpsjon/eluering og polyetylenglykolutfelling^12-17. Blant dem har SMF blitt ansett som en billig og effektiv metode, vellykket testet og brukt for å gjenopprette virus, inkludert SARS-CoV-2, fra avløpsvann og overflatevann^12,15,16,18. SMF-prosedyren er en relativt ny tilnærming som har fått økt anerkjennelse blant mange miljøstudier som en hensiktsmessig metode for samtidig å gjenvinne et bredt spekter av mikroorganismer som virus, bakterier og protozoer fra alle typer vannprøver, nemlig slam, rå kloakk, avløpsvann og avløpsprøver¹⁹. Sammenlignet med andre kjente metoder for å gjenopprette virus fra miljøprøver som ultrafiltrering og glycin-alkalisk eluering, lyofiliseringsbasert tilnærming eller ultrasentrifugering og glycin-alkalisk eluering, har SMF blitt rapportert som den mest effektive metoden med høyere viral utvinning og deteksjonsrater^18,20. I denne studien brukte vi pansret RNA som et testvirus for å vurdere utvinningseffektiviteten av viruskonsentrasjonsmetoder, inkludert tester for å vurdere SARS-CoV-2-utvinning^21,22.

Her testet vi avløpsvann og miljøvannprøver for å demonstrere nytten av SMF og en sekvensiell ultrafiltreringsmetode for å konsentrere mikrobielle fraksjoner for kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR), sekvensbasert metagenomikk og dypamplikonsekvensering. SMF er en relativt billigere metode og optimal for et større prøvevolum sammenlignet med ultrafiltreringsmetoder. Ideen om å bruke en sekvensiell ultrafiltreringsmetode oppsto fra nødvendigheten av å redusere det endelige volumet av viruskonsentratene under COVID-19-pandemien, da tilførselen av de vanlige ultrafiltreringsenhetene var begrenset, og det var behov for utvikling av alternative virale konsentrasjonsmetoder.

Protocol

1. Sammenligning av seriell ultrafiltrering og skummetmelkflokkulering for å konsentrere virus i avløpsvannprøver Prøve forberedelseSamle 2 l av 24 timers strømningsproporsjonale komposittrå (påvirkende) avløpsvannprøver. Prøver ble samlet inn fra de tre store renseanleggene (WWTP) i Winnipeg i Canada sommeren og høsten 2020 (tabell 1). Transporter prøvene til laboratoriet i lystette flasker i en isboks og behandle dem innen 24 timer. Samle avløp…

Representative Results

Evaluering av virale RNA-konsentrasjonsmetoderAlle seks prøvene behandlet med UF-3k x g var positive og resulterte i en 13,38% ± 8,14% utvinning (figur 1). Bare en prøve var positiv når prøvene ble behandlet med UF-7.5k x g. Alle prøver behandlet med SMF var positive og resulterte i en 15,27% ± 2,65% utvinning (figur 1). Den gjennomsnittlige utvinningsgraden for UF-3K x g og SMF var signifikant og konsekvent (p</…

Discussion

Et av de kritiske trinnene i denne studien er eliminering av faste partikler ved å påføre et forfiltreringstrinn med 0,2 μm og 0,45 μm membranfiltre. Med tanke på partisjonering av virus i faste partikler, spesielt innkapslede virus, kan forfiltrering forårsake et betydelig tap i viral utvinning³⁰. Mens et forfiltreringstrinn for ultrafiltreringsmetoder nesten alltid er nødvendig for miljø- og avløpsvannprøver for å forhindre at ultrafiltreringsenheter tettes, kan det være nødvendig …

Materials

0.2 M sodium phosphate buffer with a pH 7.5	Alfa Aesar	J62041AP	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
0.2 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters	VWR	66234	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
0.45 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters	VWR	60043	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4444432	Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Armored RNA Quant IPC-1 Processing Control	Asuragen	49650	Asuragen, Austin, TX, USA
Brand A, Jumbosep Centrifugal Device, 30-kDa	Pall	OD030C65	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Brand B, Microsep Advance Centrifugal Device, 30-kDa	Pall	MCP010C46	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Centrifuge tubes (50 ml)	Nalgene	3119-0050PK	Thermo Fisher Scientific
DNAse I	Invitrogen	18047019	Thermo Fisher Scientific
Dyna Mag-2	Invitrogen	12027	Thermo Fisher Scientific
GWV High Capacity Groundwater Sampling Capsules – 0.45 µm	Pall	12179	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Hydrochloric acid, 1N standard solution	Thermo Fisher Scientific	AC124210025	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit	Applied biosystems	A42358	Thermo Fisher Scientific
Nuclease free water	Promega	P1197	Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA
Peristaltic pump	Masterflex, Cole-Parmer instrument	7553-20	Thermo Fisher Scientific
pH meter	Denver instrument	RK-59503-25	Cole-Parmer. This product has been discontinued
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1	Invitrogen	15593031	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Primers and probe sets	IDT		Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kit	Qiagen		Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
QuantStudio 5 Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	A34322	Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Qubit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) assay kit	Invitrogen	Q33231	Thermo Fisher Scientific
Qubit 4 Fluorometer, with WiFi	Invitrogen	Q33238	Thermo Fisher Scientific
Qubit RNA High Sensitivity (HS) assay kit	Invitrogen	Q32855	Thermo Fisher Scientific
RNAse A	Invitrogen	EN0531	Thermo Fisher Scientific
RNeasy PowerMicrobiome Kit	Qiagen	26000-50	Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
Skim milk powder	Difco (BD Life Sciences)	DF0032173	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Sodium phosphate buffer	Alfa Aesar		Alfa Aesar, Ottawa, ON, Canada
Synthetic seawater	VWR	RC8363-1	RICCA chemical company
Synthetic single-stranded DNA gBlock	IDT		Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices – 0.1 µm, 90 mm, gamma-irradiated	Pall	4621	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices – 0.2 µm, 90 mm, gamma-irradiated	Pall	4622	Pall Corporation, Ann Arbor, MI
β-mercaptoethanol	Gibco	21985023	Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA