Summary
Het voorgestelde protocol bevat richtlijnen over hoe besmetting met endotoxine kan worden voorkomen tijdens de isolatie van extracellulaire blaasjes uit celkweeksupernatanten en hoe deze op de juiste manier kunnen worden geëvalueerd.
Abstract
Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn een heterogene populatie van membraanblaasjes die door cellen in vitro en in vivo worden vrijgegeven. Hun alomtegenwoordigheid en belangrijke rol als dragers van biologische informatie maken hen tot intrigerende studieobjecten, die betrouwbare en repetitieve protocollen vereisen voor hun isolatie. Het realiseren van hun volledige potentieel is echter moeilijk omdat er nog steeds veel technische obstakels zijn die verband houden met hun onderzoek (zoals de juiste acquisitie). Deze studie presenteert een protocol voor de isolatie van kleine EV's (volgens de MISEV 2018-nomenclatuur) uit het kweeksupernatant van tumorcellijnen op basis van differentiële centrifugatie. Het protocol bevat richtlijnen over hoe besmetting met endotoxinen tijdens de isolatie van EV's kan worden voorkomen en hoe deze goed kunnen worden geëvalueerd. Endotoxinebesmetting van EV's kan latere experimenten aanzienlijk belemmeren of zelfs hun ware biologische effecten maskeren. Aan de andere kant kan de over het hoofd geziene aanwezigheid van endotoxinen leiden tot onjuiste conclusies. Dit is van bijzonder belang wanneer wordt verwezen naar cellen van het immuunsysteem, waaronder monocyten, omdat monocyten een populatie vormen die bijzonder gevoelig is voor endotoxineresiduen. Daarom wordt het ten zeerste aanbevolen om EV's te screenen op endotoxinebesmetting, vooral bij het werken met endotoxinegevoelige cellen zoals monocyten, macrofagen, van myeloïden afgeleide suppressorcellen of dendritische cellen.
Introduction
Extracellulaire blaasjes (EV's), volgens de MISEV 2018-nomenclatuur, zijn een verzamelnaam die verschillende subtypen van door cellen uitgescheiden vliezige blaasjes beschrijft die een cruciale rol spelen in tal van fysiologische en pathologische processen 1,2. Bovendien zijn EV's veelbelovend als nieuwe biomarkers voor verschillende ziekten, evenals therapeutische middelen en voertuigen voor medicijnafgifte. Het realiseren van hun volledige potentieel is echter moeilijk omdat er nog steeds veel technische obstakels zijn met betrekking tot hun overname3. Een van die uitdagingen is de isolatie van endotoxinevrije EV's, die in veel gevallen is verwaarloosd. Een van de meest voorkomende endotoxinen is lipopolysaccharide (LPS), dat een belangrijk onderdeel is van gramnegatieve bacteriële celwanden en een acute ontstekingsreactie kan veroorzaken, als gevolg van de afgifte van een groot aantal inflammatoire cytokines door verschillende cellen 4,5. LPS induceert een respons door binding aan LPS-bindend eiwit, gevolgd door interactie met het CD14/TLR4/MD2-complex op myeloïde cellen. Deze interactie leidt tot de activering van MyD88- en TRIF-afhankelijke signaalroutes, die op hun beurt de nucleaire factor kappa B (NFkB) activeren. Translocatie van NFkB naar de kern initieert de productie van cytokines6. Monocyten en macrofagen zijn zeer gevoelig voor LPS en hun blootstelling aan LPS resulteert in een afgifte van inflammatoire cytokines en chemokines (bijv. IL-6, IL-12, CXCL8 en TNF-α)7,8. De CD14-structuur maakt de binding van verschillende LPS-soorten met vergelijkbare affiniteit mogelijk en dient als co-receptor voor andere toll-like receptoren (TLRs) (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 en 9)6. Het aantal studies dat wordt uitgevoerd naar de effecten van EV's op monocyten/macrofagen neemt nog steeds toemet 9,10,11. Vooral vanuit het perspectief van het bestuderen van de functies van monocyten, hun subpopulaties en andere immuuncellen, is de aanwezigheid van endotoxine en zelfs hun gemaskeerde aanwezigheid in EV's van groot belang12. De over het hoofd geziene besmetting van EV's met endotoxinen kan leiden tot misleidende conclusies en hun ware biologische activiteit verbergen. Met andere woorden, het werken met monocytische cellen vereist vertrouwen in de afwezigheid van endotoxinebesmetting13. Potentiële bronnen van endotoxinen kunnen water, commercieel verkregen media en sera, mediacomponenten en additieven, laboratoriumglaswerk en plasticwarezijn 5,14,15.
Daarom was deze studie gericht op het ontwikkelen van een protocol voor de isolatie van laag-endotoxine-bevattende EV's. Het protocol geeft eenvoudige tips over hoe endotoxinebesmetting tijdens EV-isolatie kan worden voorkomen in plaats van endotoxinen uit EV's te verwijderen. Eerder zijn veel protocollen gepresenteerd over het verwijderen van endotoxinen uit bijvoorbeeld gemanipuleerde nanodeeltjes die worden gebruikt in de nanogeneeskunde; geen van hen is echter nuttig voor biologische structuren zoals EV's. De effectieve depyrogenering van nanodeeltjes kan worden uitgevoerd door ethanol- of azijnzuurspoeling, verwarming bij 175 °C gedurende 3 uur, γ bestraling of triton X-100-behandeling; deze procedures leiden echter tot de vernietiging van EV's16,17.
Het gepresenteerde protocol is een baanbrekend onderzoek gericht op het vermijden van endotoxine onzuiverheden in EV's, in tegenstelling tot eerdere studies over het effect van EV's op monocyten9. Het toepassen van voorgestelde principes op de laboratoriumpraktijk kan helpen om betrouwbare onderzoeksresultaten te verkrijgen, wat cruciaal kan zijn bij het overwegen van het potentiële gebruik van EV's als therapeutische middelen in de kliniek12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van ultracentrifugebuizen
- Gebruik steriele buizen voor eenmalig gebruik. Als dit niet mogelijk is, hergebruik de ultracentrifugebuizen dan nadat u ze met een reinigingsmiddel hebt gewassen met een steriele Pasteur-pipet of andere applicators voor eenmalig gebruik. Vergeet niet dat ultracentrifugebuizen moeten worden gewijd aan één type gecentrifugeerd materiaal (celkweeksupernatant / serum / plasma) en soorten (mens / muis / enz.).
- Spoel na een wasmiddelwasbeurt de ultracentrifugebuizen 3x af met gedeïoniseerd, LPS-vrij water.
OPMERKING: Gebruik geen water van lage kwaliteit. - Droog de ultracentrifugebuizen en vul ze vervolgens met 70% ethanol. Laat de buizen met 70% ethanol staan voor nachtelijke desinfectie. Verwijder de ethanol en droog de buisjes opnieuw.
- Plaats de tubes en doppen in een sterilisatieverpakking en sluit ze goed af. Gebruik de plasma- of gassterilisatiemethode (ethyleenoxide)18,19. Bewaar de ultracentrifugebuizen in de sterilisatieverpakking op een droge plaats en gebruik ze vóór de vervaldatum.
OPMERKING: Voer maandelijkse monitoring uit van het LPS-niveau in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en het water dat wordt gebruikt voor ev-isolatie. De controle moet ook de buizen omvatten (bijvoorbeeld door het water [wascontrole] te testen dat 's nachts bij kamertemperatuur [RT] in de ultracentrifugebuizen is opgeslagen).
2. Bereiding van EV-uitgeput foetaal runderserum met laag endotoxine (EE-FBS)
- Zorg ervoor dat u ultralaag endotoxine FBS gebruikt (in de handel verkrijgbaar; zie materiaaltabel; <0,1 EU/ml).
- Plaats een fles ultra-laag endotoxine FBS in een waterbad en incubeer gedurende 30 minuten bij 56 °C. Deze stap is nodig om het complementsysteem te deactiveren.
- Pipetteer de geïnactiveerde FBS naar ultracentrifugebuizen en centrifugeer deze gedurende 4 uur bij 4 °C op 100.000 x g . Verzamel het supernatant in steriele buizen van 50 ml en zorg ervoor dat het niet meer dan 45 ml per buis overschrijdt om verontreiniging van de dop en bevochtiging van de ring van de buis te voorkomen.
- Bewaar het aldus bereide EE-FBS-serum bij -20 °C. Controleer de concentratie LPS in EE-FBS (stap 6). De LPS-concentratie moet op hetzelfde niveau liggen als vóór ultracentrifugatie.
3. Celkweek
- Voor deze studie kweekte SW480 en SW620 cellijnen in Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) met 4,5 g/L glucose, L-glutamine, natriumpyruvaat en gentamicine (50 μL/ml) aangevuld met 10% EE-FBS dienovereenkomstig in 75 cm2 kweekkolven met behulp van aseptische techniek. Zaai bijna 4,5 x 10 6 cellen en 6,5 x 106 cellen per kolf voor respectievelijk SW480 en SW620.
- Verzamel de supernatanten twee keer per week (~ 10 ml per kolf) wanneer de cellen volledige confluentie bereiken (~ 13,5 x 10 6 en 20 x 106 cellen per kolf voor respectievelijk SW480 en SW620) en splits. Zorg ervoor dat de levensvatbaarheid van de cellen niet minder dan 99% is en dat de cellen bij 37 °C in een CO 2-atmosfeer van 5% worden gekweekt.
- Verzamel supernatanten uit de celcultuur in correct gelabelde buisjes van 15 ml. Centrifugeer de verzamelde supernatanten op 500 x g gedurende 5 minuten bij RT om celresten te verwijderen.
- Verzamel de supernatanten zorgvuldig, vermijd aanzuigend vuil, plaats in geëtiketteerde buizen en centrifugeer opnieuw bij 3.200 x g gedurende 12 minuten bij 4 °C.
- Verzamel supernatanten van de tweede centrifugatiestap in steriele, gelabelde buizen van 50 ml. Vermijd het bevochtigen van de randen van buizen. Zorg ervoor dat het volume van het supernatant niet groter is dan 45 ml en dat de buizen verticaal worden gehouden.
- Wikkel de dop van de buis met een steriele transparante film en bewaar supernatanten in de verticale positie bij -80 °C.
OPMERKING: Voer maandelijkse controle van Mycoplasma spp. en LPS-besmetting in verse kweeksupernatanten (stap 6). Als het niveau van endotoxine in de supernatanten hoger is dan 0,05 EU/ml, controleer dan in welk stadium besmetting kan hebben plaatsgevonden en start het proces opnieuw vanaf het begin. Als besmetting van de celkweek door Mycoplasma spp. wordt gedetecteerd, moet de isolatie van de EV's van dergelijke supernatanten worden gestaakt.
4. Isolatie van EV's uit celkweeksupernatanten
- Bereid spuitfilters van 0,22 μm en spuiten met het juiste volume voor. Bereid twee buizen met kweeksupernatanten (90 ml).
- Vul de spuit met het supernatant en bevestig het filter aan de naaldadapter. Plaats de gevulde spuit met het filter over een tube van 50 ml. Druk op de zuigerflens en verzamel ~ 90 ml filtraat.
- Pipetteer het filtraat (7 ml) naar de ultracentrifugebuizen (zorg ervoor dat hetzelfde volume naar elke buis wordt gepipetteerd voor een goede balans) en centrifugeer gedurende 2 uur bij 4 °C op 100.000 x g .
OPMERKING: De efficiëntie van EV's pelleteren hangt af van vele factoren (bijv. rotortype, k-factor, migratiepadlengte, de viscositeit van het medium, enz.), Die moeten worden geoptimaliseerd voor een beter herstel van EV's20. - Gooi het supernatant weg met een steriele Pasteurpipet. Verzamel de resterende pellets met lange, gefilterde pipetpunten en bundel ze in twee ultracentrifugebuizen. Vul ze tot 7 ml met gefilterde endotoxinevrije PBS om de EV's te spoelen.
- Centrifugeer de PBS-geresuspendeerde pellets bij 100.000 x g gedurende 2 uur bij 4 °C. Verwijder het supernatant volledig met behulp van een steriele Pasteur-pipet en voeg 200 μL gefilterde, endotoxinevrije PBS toe aan beide buizen om de EV's te resuspenderen. Pipeteer de EV's voorzichtig om alle EV's te verzamelen.
- Breng de EV-suspensie over in een steriele reageerbuis van 1,5 ml (gebruik indien mogelijk een buis met een lage eiwitbinding). Bewaar 10 μl van de EV-suspensie voor het bereiden van een verdunning voor analyse van het volgen van nanodeeltjes (NTA) en voor andere doeleinden (bijv. meting van de eiwitconcentratie).
- Verdun de EV's met gefilterde PBS (1:1.000) voor metingen door NTA, volgens de instructies van de fabrikant. Zet de EV-buizen vast door de dop te omwikkelen met een steriele transparante folie. Bewaar de EV's bij -80 °C.
5. Specifieke markers detectie door western blotting
- Bepaal het eiwitgehalte in de monsters (bijvoorbeeld door Bradford-assay) en bereid de monsters (20 μg) voor met laadbuffer. Bereid de laadbuffer door 5 μL monsterbuffer (4x) en 2 μL monsterreductiemiddel (10x) te mengen tot een totaal volume van 20 μL. Incubeer de monsters bij 70 °C gedurende 10 min.
- Bereid polyacrylamidegels voor met SDS (10% -14%) en laad de 20 μg EV's in elke put.
- Voer de elektroforese met lopende buffer (30 g Tris, 144 g glycine, 10% SDS per 1 L) gedurende 45 minuten uit bij 150 V.
- Voer semi-droge overdracht van eiwitten van de gel uit op het polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan in een transfermachine met Towbin-buffer (1,51 g Tris, 7,2 g glycine, 10% methanol per 0,5 L) bij 25 V gedurende 1 uur.
- Plaats het membraan in TBST-buffer (1 ml Tween, 100 ml Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS 10x) per 1 L) voor blokkering met 1% runderserumalbumine (BSA) in TBST-buffer en incubeer gedurende 1 uur op de rocker bij RT.
- Voeg verdunde (1:1.000) antilichamen, anti-CD9 1 (kloon#D8O1A) of anti-Alix 1 (kloon#3A9) toe in1% BSA en incubeer met het membraan 's nachts bij 4 °C op de rocker. Verwijder antilichamen en was het membraan 3x met 10 ml 1x TBST gedurende 10 minuten.
- Voeg geit anti-konijn of geit anti-muis (verdunning: 1:2.000) secundair antilichaam geconjugeerd met mierikswortelperoxidase toe, afhankelijk van het primaire antilichaam op het membraan, en incubeer gedurende 1 uur op de rocker bij RT. Verwijder antilichamen en was membraan 3x met 10 ml 1x TBST gedurende 10 minuten.
- Meng het substraat en luminol in een verhouding van 1:1 om een oplossing van 1 ml te verkrijgen. Giet de oplossing op het membraan. Plaats het membraan onmiddellijk in de meetkamer van het beeldvormingssysteem, kies de chemiluminescentiemodule en visualiseer eiwitbanden op het scherm.
6. Meting van het endotoxinegehalte door de Limulus Amebocyte Lysate-test (LAL)
- Voer chromogene LAL-meting van het endotoxineniveau uit, volgens de aanbeveling van de fabrikant. Gebruik in het kort de methode gebaseerd op de interactie van het endotoxine met het limulus amebocyte lysaat (LAL). De detectiegrens van deze methode is 0,005 EU/ml.
OPMERKING: LAL-test blijft, ondanks zijn beperkingen, momenteel de standaardmethode voor het detecteren en kwantificeren van endotoxinebesmetting in verschillende soorten oplossingen en andere producten die in de wetenschap of geneeskunde worden gebruikt8. De beperkende factor van deze kit is de stabiliteit van de gereconstitueerde amebocytenlysaatoplossing, die slechts 1 week stabiel is bij -20 °C indien onmiddellijk na reconstitutie bevroren. - Gebruik een tienvoudige verdunning van EV's en andere monsters en een 50-voudige verdunning van serum. Gebruik voor verdere experimenten alleen reagentia met een laag endotoxinegehalte, zoals EE-FBS, DMEM, PBS, RPMI (<0,005 EU/ml) en LPS-vrije kweeksupernatanten.
7. Detectie van prokaryote 16S rRNA-gen in EV-monsters
- Isoleer DNA uit de EV-monsters. Probeer de reagentia en de plaats van isolatie aseptisch te houden. Meet de DNA-concentratie en -kwaliteit (bijvoorbeeld met behulp van een spectrofotometer).
- Voer polymerasekettingreactie (PCR) uit, zoals eerder beschreven21. Bereid 1,5% agarosegel met ethidiumbromide of SYBR-groen om de PCR-producten in ultraviolet licht (UV) te visualiseren.
- Voer elektroforese van het monster en de gewichtsmarker uit met TRIS-acetaat-EDTA-buffer op 75 V gedurende 45 minuten. Visualiseer DNA-banden met behulp van het beeldvormingssysteem.
8. Bepaling van de effectieve LPS-concentratie voor stimulatie in het humaan monocytenmodel
- Bereid 2 x 106 monocyten / ml monocytensuspensie in RPMI 1640 aangevuld met L-glutamine, glucose en 2% EE-FBS. Voeg 50 μL van de suspensie per put van een 96-well weefselkweekplaat22 toe.
- Voeg een geschikt volume LPS of kweekmedium toe om de volgende eindconcentraties te verkrijgen: 0 pg/ml (controle), 10 pg/ml, 50 pg/ml, 100 pg/ml, 1 ng/ml en 100 ng/ml, in 100 μl totaal volume van de celsuspensie. Maak drievouden van elke LPS-concentratie.
- Kweek de cellen gedurende 18 uur bij 37 °C, 5% CO2. Verzamel het supernatant.
- Draai het supernatant op 2.000 x g gedurende 5 minuten. Breng de supernatanten over in nieuwe buizen. Meet TNF8,23 en IL-10 23 concentratie in verzamelde supernatanten met de cytometrische kralen array (CBA) humane cytokine kit, volgens de procedure van de fabrikant, met een flowcytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een vereiste of verplichte stap voor dit protocol is de uitsluiting van mogelijke endotoxineverontreiniging uit reagentia. Alle reagentia die worden gebruikt, zoals FBS, DMEM, RPMI, PBS en zelfs ultracentrifugebuizen, moeten endotoxinevrij zijn (<0,005 EU / ml). Het handhaven van het regime van geen endotoxinebesmetting is niet eenvoudig, omdat bijvoorbeeld het reguliere/standaardserum voor celkweek de rijke bron kan zijn (0,364 EU/ml; zie tabel 1).
Hoewel dit protocol is ontwikkeld om EV's met een laag endotoxinegehalte te isoleren, is het belangrijk om de geïsoleerde EV's te karakteriseren. In deze studie werden de EV's geïsoleerd uit twee colorectale kankercellijnen, SW480 en SW620. De expressie van EV-markers, CD9 en Alix, werd bevestigd door western blot (figuur 1A). Er was geen verschil in de gemiddelde grootte van EV's geïsoleerd uit SW480- en SW620-cellen (respectievelijk 134 nm en 128,2 nm; Figuur 1B). Bovendien waren er geen verschillen in de concentratie van geïsoleerde EV's tussen deze cellijnen (figuur 1C). De voorbeeldige verdelingen van EV-grootte, zoals gemeten door NTA, zijn weergegeven in figuur 1D. De tijd van ultracentrifugatie werd geoptimaliseerd volgens de resultaten van Cvjetkovic et al.20. In het kort werd de wiskundige formule gebruikt voor de conversie van centrifugale loopparameters tussen twee rotoren met een vaste hoek (70Ti en T-1270). De effectiviteit van de uitputting van kleine EV's door 120 minuten met een T-1270 rotor te draaien bij 100.000 x g was iets minder dan die bereikt door een 70Ti-rotor te gebruiken bij 118.000 x g gedurende 155 minuten; het was echter nog steeds in het bereik van effectieve RNA- en eiwitpellets. De berekening werd bevestigd door experimentele gegevens (tabel S1), waarbij de verlengde centrifugatietijd (4 uur versus 2 uur) geen betekenisvolle invloed had op het aantal EV's dat gepelletiseerd of nog aanwezig was in supernatanten.
Het niveau van LPS dat een monocytenrespons veroorzaakte, werd beoordeeld. Voor dit doel werden menselijke monocyten gekweekt met opeenvolgende concentraties LPS (0 pg / ml, 10 pg / ml, 50 pg / ml, 100 pg / ml, 1 ng / ml en 100 ng / ml). Na de nachtelijke kweek werd het niveau van IL-10 en TNF bepaald in de kweeksupernatanten. In deze studie was de laagste dosis LPS die de secretie van IL-10 en TNF in monocyten mogelijk maakte 50 pg/ml, wat overeenkwam met 0,5 EU/ml (figuur 2).
Ten slotte was de laatste stap gerelateerd aan het testen van het niveau van LPS in de EV's geïsoleerd zoals hierboven. De LPS-verontreiniging van de EV-monsters was ongeveer 0,5 EU/ml (50 pg/ml; Figuur 3) voor beide cellijnen (45,80 ± 20,39 pg/ml en 48,75 ± 7,412 pg/ml voor respectievelijk SW480 en SW620). Dit betekent dat 1 μl EV's (ongeveer 109 EV's) minder dan 0,05 pg endotoxine bevat en wanneer toegevoegd aan 100 μl monocytensuspensie (verhouding van 104 EV's per monocyt) 100 keer wordt verdund (de uiteindelijke concentratie LPS is ongeveer 0,5 pg / ml).
Bovendien werd de zuiverheid van EV's getest door PCR voor 16S rRNA-gen21, wat het gebrek aan bacteriële besmetting bevestigt in EV's geïsoleerd uit SW480- en SW620-cellijnen (aanvullende figuur 1).
Figuur 1: Karakterisering van geïsoleerde EV's. (A) Western blot analyse van de eiwitmarkers van EV's geïsoleerd uit SW480 en SW620 cellijnen. (B) NTA werd gebruikt om de grootte te meten van EV's geïsoleerd van SW480- en SW620-cellijnen (nm). (C) NTA werd gebruikt om de concentratie van EV's geïsoleerd uit SW480- en SW620-cellijnen (EV's/ml) te meten. (D) Voorbeeldige verdelingen van de grootte van de EV's, zoals gemeten door NTA (blauwe getallen geven de deeltjesgrootte op een bepaald punt op de curve aan). Gegevens in B en C worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD (n = 10); T-test voor statistische analyse werd gebruikt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: IL-10 en TNF secretie door monocyten gestimuleerd met verschillende doses LPS. Secretie van cytokines door monocyten werd bepaald na stimulatie met LPS-doses zoals aangegeven: 10 pg / ml, 50 pg / ml, 100 pg / ml, 1 ng / ml en 100 ng / ml, in vergelijking met controlemonocyten (MO). De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD (n = 4); Mann-Whitney U test werd gebruikt. TNF- en IL-10-concentraties werden gemeten in kweeksupernatanten met behulp van de cytometrische kralenarray (CBA) -methode. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Meting van het LPS-niveau in geïsoleerde EV-monsters door middel van chromogene LAL-test. LPS-gehalte in EV-monsters verkregen uit SW480- en SW620-cellijnen (pg/ml). De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD (n = 6). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| S.No. | monster | endotoxinegehalte [EU/ml] | endotoxinegehalte [pg/ml] | ||
| 1 | Dmin | <0,005 | <0,5 | ||
| 2 | RPMI1640 | <0,005 | <0,5 | ||
| 3 | FBS ultra laag endotoxine | <0,005 | <0,5 | ||
| 4 | FBS ultra laag endotoxine na 4 uur centrifugeren (EE-FBS) | <0,005 | <0,5 | ||
| 5 | reguliere FBS | 0.368 | 36.8 | ||
| 6 | gefilterde PBS | <0,005 | <0,5 | ||
| 7 | kweeksupernatant vorm SW480 cellen na 2 h centrifigatie | <0,005 | <0,5 | ||
| 8 | kweeksupernatant uit SW620-cellen na 2 uur centrifugeren | <0,005 | <0,5 | ||
| 9 | wascontrole (water opgeslagen in ultracentrifugebuizen) | <0,005 | <0,5 | ||
Tabel 1: LPS-gehalte in verschillende reagentia en monsters bepaald door chromogene LAL-test. Metingen worden gepresenteerd als EU/ml en pg/ml. Monsters omvatten DMEM, RPMI, EE-FBS, FBS, gefilterde PBS en wascontrole (water uit ultracentrifugatiebuizen).
Aanvullende tabel 1: Representatieve voorbeelden van EV-concentratie- (EV's/ml) en groottemetingen (nm) in pellets en supernatanten na 2 uur of 4 uur centrifugeren van kweeksupernatanten van SW480- en SW620-cellijnen en PBS. Metingen werden uitgevoerd door NTA. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 1: PCR-resultaten van pan-prokaryote 16S rRNA-genamplificatie in de volgende monsters, van links: molecuulgewichtsladder (MW, 100-1000 bp), NC-negatieve controle, EV's afgeleid van SW480 en SW620, en PC (positief controle-bacterieel DNA) Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In de afgelopen jaren zijn methoden voor een goede EV-isolatie steeds belangrijker geworden, waardoor hun verdere betrouwbare analyses mogelijk zijn, bijvoorbeeld in het kader van het verkrijgen van betrouwbare omica en functionele gegevens24. Op basis van eerdere onderzoekservaring lijkt het erop dat niet alleen het type isolatiemethode, maar ook andere aandoeningen tijdens deze procedure belangrijk kunnen zijn. Het gebruik van EV-uitgeputte FBS wordt algemeen erkend als een noodzaak25,26; de monitoring van endotoxinebesmetting in EV's wordt echter vaak verwaarloosd.
Niettemin moeten alle methoden die worden gebruikt voor de isolatie van EV's normen hebben ontwikkeld voor rigoureuze aseptische hantering en kwaliteitscontrole in elke fase van de procedure. Dit is met name van belang vanwege de verdere downstream-toepassing van EV's. Het voorgestelde protocol is het resultaat van eerdere ervaringen met endotoxinegevoelige cellen, zoals monocyten en macrofagen, die endotoxinegevoelig zijn. CD14, een marker van monocyten, is in staat om LPS te binden bij picomolaire concentraties. Verkregen resultaten geven aan dat monocyten, na stimulatie met 50 pg/ml (0,5 EU/ml) LPS, TNF en IL-10 afscheiden. Yang et al. meldden echter dat zelfs 0,1 EU/ml (10 pg/ml) endotoxine een krachtige reactie (upregulatie van het inflammatoire IL1B-gen ) zou kunnen veroorzaken27. Bovendien toonden Chaiwut et al. aan dat de intracellulaire productie van TNF en IL-6 in monocyten kan worden geïnduceerd door nog lagere concentraties LPS, respectievelijk 2,5 pg / ml of 5 pg / ml23. Alvarez et al. bevestigden dat de activeringssnelheid van monocyten (berekende waarde) stijgt na een kleine concentratie LPS, zoals 5 pg / ml28. Daarom is het beperken van endotoxinebesmetting in EV's in elke mogelijke fase van het isolatieprotocol cruciaal voor verdere experimenten met LPS-gevoelige cellen. Momenteel is ultracentrifugatie de meest gebruikte methode voor EV-isolatie. Voor zover bekend zijn er echter geen studies over de LPS-verontreiniging van EV's die door deze methode worden geïsoleerd. Daarom richt het bovenstaande protocol zich op het verkrijgen van ev's met een laag endotoxine zonder externe EV's die door de kweeksupernatanten worden geconcretiseerd.
Zoals hierboven vermeld, kan endotoxinebesmetting verschillende bronnen hebben. Ten eerste moet worden benadrukt dat endotoxine een taaie oppponent is en dat niet alle methoden voor sterilisatie van glas of plastic bestek effectief zijn bij het verwijderen of afbreken ervan. De standaard autoclaverprocedure kan lps bijvoorbeeld niet elimineren vanwege de hoge hittestabiliteit van endotoxine27. Ook kan wassen, zelfs uitgebreid, endotoxine niet volledig verwijderen. Door meer depyrogene methoden toe te passen op de laboratoriumpraktijk, zoals plasma of ETO (ethyleenoxide) sterilisatie18,19, kan endotoxinebesmetting worden beperkt. Vervolgens zijn permanente monitoring en preventie van mogelijke besmetting cruciaal. De gepresenteerde resultaten wijzen op het belang van het gebruik van ultralage endotoxine-reagentia, zoals serum, voor kweeksuppletie. Bovendien wordt routinematige controle van endotoxineverontreiniging van alle reagentia (zoals PBS, DMEM en RPMI) en zelfs plasticware (bijv. Buizen) ten zeerste aanbevolen. Het is ook noodzakelijk om de kweeksupernatanten vooraf te controleren voordat EV's worden geïsoleerd om endotoxineaccumulatie te voorkomen. Zoals hierboven gepresenteerd, is een interessant alternatief voor de standaardmeting van endotoxineniveaus door LAL-assay PCR-amplificatie van het bacteriële 16s-rRNA-gen. Bepaling van permissieve (die geen monocytenstimulatie induceert) endotoxineniveaus van LPS in EV's is cruciaal. Rekening houdend met de kweekomstandigheden (concentratie van monocyten en verontreiniging met LPS van de toegepaste EV's, de concentratie van EV's; Figuur 3), is de uiteindelijke concentratie van endotoxine die monocyten beïnvloedt die worden gestimuleerd met EV's niet hoger dan 0,5 pg / ml (EV's worden meestal 100-1.000 keer verdund). Deze dosis is vijf keer lager dan die gepostuleerd door Chaiwut et al. als de minst effectieve dosis (2,5 pg / ml) die in staat is om de productie van TNF door monocyten te induceren23. In de Chaiwut et al. studie werd cytokineproductie bepaald met behulp van flowcytometrie en gepresenteerd als een MFI (gemiddelde fluorescerende intensiteit) verschuiving zonder kwantificering. Bovendien werd monocytenstimulatie met zeer lage doses LPS uitgevoerd in medium aangevuld met 10% FBS, wat een extra bron van LPS23 kan zijn. Dit kan erop wijzen dat de effectieve dosis LPS die werd gebruikt voor monocytenstimulatie hoger was. Gezien de gepresenteerde resultaten en literatuurgegevens lijkt het er dus op dat de concentratie van endotoxine tot 50 pg/ml (0,5 EU/ml) in EV's toelaatbaar is en niet de oorzaak is van de activering van monocyten. De volgende stap in het optimaliseren van dit protocol is verdere vermindering van endotoxinebesmetting, zelfs tot het niveau dat niet wordt gedetecteerd door LAL of celgebaseerde assays. Onlangs is het belang van het gebruik van biologische modellen om gemaskeerde endotoxinebesmetting te detecteren, genaamd laag endotoxineherstel (LER), sterk aanbevolen8.
Dit protocol is dus innovatief in dit opzicht omdat het alle aspecten verzamelt die nodig zijn voor de isolatie van EV's met een zo laag mogelijk endotoxinegehalte, dat nog niet in andere studies is behandeld.
Zoals bij elke methode heeft dit protocol enkele beperkingen. Ten eerste vermindert het voorgestelde protocol de endotoxinebesmetting, maar elimineert het deze niet. Ten tweede is het onbekend of de bereikte zuiverheid voldoende is voor andere immuuncellen. Daarom moet elk protocol worden aangepast voor verdere toepassing. Het opstellen van een dergelijk protocol zal het mogelijk maken resultaten te verkrijgen die meer overeenkomen met de biologisch actieve componenten van EV's dan met hun accidentele besmetting. Ten slotte is de procedure duurder dan normaal vanwege de noodzaak om verschillende endotoxinetestkits en serum met een laag endotoxinegehalte aan te schaffen. Als veelbelovend alternatief presenteerde Bussolati een nieuwe, geavanceerde methode voor EV-isolatie door tangentiële stromingsfiltratie. Deze methode maakt de verwerving van EV's met een lage endotoxiciteit (0,1-0,7 EU / ml; 10-70 pg / ml) mogelijk29. Tot nu toe is deze nieuwe methode niet vaak gebruikt voor EV-isolatie en vereist gespecialiseerde apparatuur in de vorm van een tangentiële stroomfiltratie (TFF) -systeem. Onlangs stelden Gałuszka et al. een andere manier voor om endotoxine uit luchtverontreinigende stoffen (fijnstof met de grootte van EV's maar zonder membraanstructuur) te elimineren door polymyxine B30 te gebruiken. Het nut van dit protocol voor cel-afgeleide blaasjes moet echter worden geverifieerd door middel van biologische modellen, vooral wanneer wordt gedacht aan in vivo experimenten. Polymixine B en natriumdeoxycholaat (ook van toepassing op endotoxineverwijdering) zijn eerder beschreven als neuro- en nefrotoxisch31. Andere mogelijkheden zijn affiniteitskolommen met poly(ε-lysine), die selectief endotoxinen binden. Deze methode is echter snel en efficiënt, gericht op eiwitmonsters / oplossingen; daarom moet het worden toegepast op dergelijke gecompliceerde structuren als EV's moet worden gevalideerd32. Bovendien zijn deze kolommen bedoeld voor monsters met hoge initiële endotoxineniveaus en hun effectiviteit bij het verwijderen van relatief kleine hoeveelheden LPS is onbekend en vereist verificatie. De uiteindelijke verwachte concentratie van LPS na zuivering met LPS-afbrekende kolommen kan nog steeds te hoog zijn voor immuunceltests (bijvoorbeeld <5 EU/ml).
Samenvattend stelde dit protocol voor hoe endotoxinebesmetting kan worden voorkomen door verschillende principes toe te passen op de laboratoriumpraktijk, zoals een rigoureuze aseptische techniek tijdens alle stappen van EV-isolatie, het gebruik van ultralage endotoxine-reagentia, het bewaken van endotoxine-onzuiverheden bij alle procedurestappen en het wijzigen van de sterilisatiemethode. Bovendien geeft het gepresenteerde protocol aanwijzingen over hoe de endotoxineniveaus bij elke stap van de isolatieprocedure kunnen worden gecontroleerd. LPS aanwezig in EV's beïnvloedt de functie van immuuncellen en kan daarom valse resultaten veroorzaken bij testen die met deze cellen worden uitgevoerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat het onderzoek werd uitgevoerd in afwezigheid van commerciële of financiële relaties die zouden kunnen worden geconstrueerd als een potentieel belangenconflict.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het National Science Centre, Polen, subsidienummer 2019/33/B/NZ5/00647. We willen professor Tomasz Gosiewski en Agnieszka Krawczyk van de afdeling Moleculaire Medische Microbiologie, Jagiellonian University Medical College bedanken voor hun onschatbare hulp bij de detectie van bacterieel DNA in EV's.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alix (3A9) Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2171 | |
| 1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-Pyrogenic | GoogLab Scientific | GBFT1250-R-NS | |
| BD FACSCanto II Flow Cytometr | BD Biosciences | ||
| CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II | BD Biosciences | 551809 | |
| CD9 (D8O1A) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 13174 | |
| ChemiDoc Imaging System | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 17001401 | |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) | Corning | 10-013-CV | |
| ELX800NB, Universal Microplate Reader | BIO-TEK INSTRUMENTS, INC | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000044 | |
| Fetal Bovine Serum South America Ultra Low Endotoxin | Biowest | S1860-500 | |
| Gentamicin, 50 mg/mL | PAN – Biotech | P06-13100 | |
| Goat anti-Mouse IgG- HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Goat anti-Rabbit IgG- HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| Immun-Blot PVDF Membrane | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1620177 | |
| LPS from Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE) | Enzo Life Sciences, Inc. | ALX-581-009-L002 | |
| Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1703930 | |
| Nanoparticle Tracking Analysis | Malvern Instruments Ltd | ||
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Invitrogen | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) | Invitrogen | NP0004 | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | P7793 | transparent film |
| Perfect 100-1000 bp DNA Ladder | EURx | E3141-01 | |
| PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant Kit | Thermo Scientific | A39552 | |
| PP Oak Ridge Tube with sealing caps | Thermo Scientific | 3929, 03613 | |
| RPMI 1640 | RPMI-1640 (Gibco) | 11875093 | |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystem | A24811 | |
| Sorvall wX+ ULTRA SERIES Centrifuge with T-1270 rotor | Thermo Scientific | 75000100 | |
| Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1704401 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34577 | |
| SW480 cell line | American Type Culture Collection(ATCC) | ||
| SW480 cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | ||
| Syringe filter 0.22 um | TPP | 99722 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1703940 | Transfer machine |
| Transfer pipette, 3.5 mL | SARSTEDT | 86.1171.001 |
References
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).
- van Niel, G., et al. Challenges and directions in studying cell-cell communication by extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (5), 369-382 (2022).
- Ngkelo, A., Meja, K., Yeadon, M., Adcock, I., Kirkham, P. A. LPS induced inflammatory responses in human peripheral blood mononuclear cells is mediated through NOX4 and Giα dependent PI-3 kinase signalling. Journal of Inflammation. 9 (1), (2012).
- Schwarz, H., Schmittner, M., Duschl, A., Horejs-Hoeck, J. Residual endotoxin contaminations in recombinant proteins are sufficient to activate human CD1c+ dendritic cells. PLOS ONE. 9 (12), 113840 (2014).
- Zanoni, I., Granucci, F. Role of CD14 in host protection against infections and in metabolism regulation. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 32 (2013).
- Takashiba, S., et al. Differentiation of monocytes to macrophages primes cells for lipopolysaccharide stimulation via accumulation of cytoplasmic nuclear factor kB. Infection and Immunity. 67 (11), 5573-5578 (1999).
- Schwarz, H., et al.
- Danesh, A., et al. Granulocyte-derived extracellular vesicles activate monocytes and are associated with mortality in intensive care unit patients. Frontiers in Immunology. 9, 956 (2018).
- Barry, O. P., Pratico, D., Savani, R. C., FitzGerald, G. A. Modulation of monocyte-endothelial cell interactions by platelet microparticles. The Journal of Clinical Investigation. 102 (1), 136-144 (1998).
- Sadallah, S., Eken, C., Martin, P. J., Schifferli, J. A. Microparticles (ectosomes) shed by stored human platelets downregulate macrophages and modify the development of dendritic cells. Journal of Immunology. 186 (11), 6543-6552 (2011).
- Soekmadji, C., et al. The future of Extracellular Vesicles as Theranostics - an ISEV meeting report. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1809766 (2020).
- Gioannini, T. L., et al. Isolation of an endotoxin-MD-2 complex that produces Toll-like receptor 4-dependent cell activation at picomolar concentrations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (12), 4186-4191 (2004).
- Roslansky, P. F., Dawson, M. E., Novitsky, T. J. Plastics, endotoxins, and the Limulus amebocyte lysate test. Journal of Parenteral Science and Technology. 45 (2), 83-87 (1991).
- Fishel, S., Jackson, P., Webster, J., Faratian, B. Endotoxins in culture medium for human in vitro fertilization. Fertility and Sterility. 49 (1), 108-111 (1988).
- Schulz, E., Karagianni, A., Koch, M., Fuhrmann, G. Hot EVs - How temperature affects extracellular vesicles. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 5 (146), 55-63 (2020).
- Osteikoetxea, X., et al. Differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations. Organic & Biomolecular Chemistry. 13 (38), 9775-9782 (2015).
- Sakudo, A., Yagyu, Y., Onodera, T. Disinfection and sterilization using plasma technology: fundamentals and future perspectives for biological applications. International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 5216 (2019).
- Shintani, H. Ethylene oxide gas sterilization of medical devices. Biocontrol Science. 22 (1), 1-16 (2017).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Salamon, D., et al. Comparison of iSeq and MiSeq as the two platforms for 16S rRNA sequencing in the study of the gut of rat microbiome. Applied Microbiology and Biotechnology. 106 (22), 7671-7681 (2022).
- Baj-Krzyworzeka, M., Szatanek, R., Weglarczyk, K., Baran, J., Zembala, M. Tumour-derived microvesicles modulate biological activity of human monocytes. Immunology Letters. 113 (2), 76-82 (2007).
- Chaiwut, R., Kasinrerk, W. Very low concentration of lipopolysaccharide can induce the production of various cytokines and chemokines in human primary monocytes. BMC Research Notes. 15 (1), 42 (2022).
- Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24858 (2014).
- Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061 (2021).
- Pham, C. V., et al. Bovine extracellular vesicles contaminate human extracellular vesicles produced in cell culture conditioned medium when 'exosome-depleted serum' is utilised. Archives of Biochemistry and Biophysics. 708, 108963 (2021).
- Li, Y., Boraschi, D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine. 11 (3), 269-287 (2016).
- Álvarez, E., et al. A system dynamics model to predict the human monocyte response to endotoxins. Frontiers in Immunology. 8, 915 (2017).
- Busatto, S., et al. Tangential flow filtration for highly efficient concentration of extracellular vesicles from large volumes of fluid. Cells. 7 (12), 273 (2018).
- Gałuszka, A., et al. Transition metal containing particulate matter promotes Th1 and Th17 inflammatory response by monocyte activation in organic and inorganic compounds dependent manner. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1227 (2020).
- Falagas, M. E., Kasiakou, S. K. Toxicity of polymyxins: a systematic review of the evidence from old and recent studies. Critical Care. 10 (1), 27 (2006).
- Petsch, D., Anspach, F. B.
