In questo protocollo, la tecnologia di lavorazione dell’olio di montone di Epimedii folium (EF) è stata ottimizzata applicando una metodologia sperimentale di superficie di progettazione-risposta Box-Behnken ed è stato studiato preliminarmente l’effetto dell’EF grezzo e ottimizzato estratto dall’acqua sullo sviluppo embrionale del pesce zebra.
Come medicina tradizionale cinese (MTC), Epimedii folium (EF) ha una storia in medicina e cibo che ha > 2.000 anni. Clinicamente, l’EF elaborato con olio di montone è spesso usato come medicinale. Negli ultimi anni, le segnalazioni di rischi per la sicurezza e reazioni avverse di prodotti che utilizzano EF come materia prima sono gradualmente aumentate. L’elaborazione può migliorare efficacemente la sicurezza della MTC. Secondo la teoria TCM, la lavorazione dell’olio di montone può ridurre la tossicità dell’EF e migliorare il suo effetto tonificante sui reni. Tuttavia, mancano ricerche e valutazioni sistematiche della tecnologia di trattamento dell’olio di montone EF. In questo studio, abbiamo utilizzato la metodologia sperimentale della superficie di progettazione-risposta Box-Behnken per ottimizzare i parametri chiave della tecnologia di lavorazione valutando il contenuto di più componenti. I risultati hanno mostrato che la tecnologia ottimale di lavorazione dell’olio di montone di EF era la seguente: riscaldare l’olio di montone a 120 °C ± 10 °C, aggiungere l’EF grezzo, saltarlo delicatamente a 189 °C ± 10 °C fino a quando non è uniformemente lucido, quindi rimuoverlo e raffreddarlo. Per ogni 100 kg di EF, devono essere utilizzati 15 kg di olio di montone. Le tossicità e le teratogenicità di un estratto acquoso di EF grezzo e olio di montone sono state confrontate in un modello di sviluppo dell’embrione di zebrafish. I risultati hanno mostrato che il gruppo di erbe grezze aveva maggiori probabilità di causare deformità del pesce zebra e la sua concentrazione EF letale semi-massima era inferiore. In conclusione, la tecnologia ottimizzata di lavorazione dell’olio di montone era stabile e affidabile, con una buona ripetibilità. Ad una certa dose, l’estratto acquoso di EF era tossico per lo sviluppo di embrioni di zebrafish e la tossicità era più forte per il farmaco grezzo che per il farmaco trasformato. I risultati hanno mostrato che la lavorazione dell’olio di montone ha ridotto la tossicità dell’EF grezzo. Questi risultati possono essere utilizzati per migliorare la qualità, l’uniformità e la sicurezza clinica dell’EF trattato con olio di montone.
Epimedii folium (EF) è le foglie essiccate di Epimedium brevicornu Maxim., Epimedium sagittatum (Sieb. et Zucc.) Maxim., Epimedium pubescens Maxim., o Epimedium koreanum Nakai. EF può essere usato per trattare l’osteoporosi, la sindrome della menopausa, noduli al seno, ipertensione, malattia coronarica e altre malattie1. Come medicina tradizionale cinese (MTC), EF ha una storia in medicina e cibo di oltre 2.000 anni. Grazie al suo basso prezzo e al notevole effetto di tonificare i reni, è ampiamente usato in medicinali e alimenti salutari. L’EF viene lavorato saltando in padella con olio di montone, un processo descritto per la prima volta nella teoria dell’elaborazione del Lei Gong scritta da Lei Xiao nel periodo Liu Song2. L’efficacia dell’EF grezzo e dell’EF saltato in padella è molto diversa. L’EF grezzo dissipa principalmente i reumatismi, mentre l’EF saltato in padella riscalda i reni per rinforzare lo yang3. Allo stato attuale, l’EF è ampiamente utilizzato come materia prima nei farmaci e negli alimenti salutari; ci sono 399 farmaci brevettati cinesi elencati, nove alimenti salutari importati e 455 alimenti salutari domestici con EF come materia prima4. Questo medicinale ha grandi prospettive di applicazione. Tuttavia, negli ultimi anni, ci sono state crescenti segnalazioni di reazioni avverse e lesioni epatiche umane causate da alimenti salutari e medicinali brevettati cinesi che utilizzano EF come materia prima, e i relativi studi di tossicità 5,6,7 hanno riferito che l’EF come materia prima ha potenziali rischi per la sicurezza.
L’elaborazione medicinale cinese si riferisce a tecniche farmaceutiche che possono ridurre o eliminare efficacemente la tossicità e migliorare la sicurezza delle MTC. Il metodo di lavorazione tradizionale di EF è la frittura in padella con olio di montone, che riduce la tossicità dell’EF e migliora il suo effetto di riscaldamento dei reni e promozione dello yang8. Questo metodo di lavorazione è incluso nella farmacopea cinese e varie specifiche di lavorazione1. Il processo di EF è specificato solo come segue: per ogni 100 kg di EF, vengono aggiunti 20 kg di olio amniotico (raffinato) e viene cotto in modo delicato fino a quando uniforme e lucido1. Non ci sono parametri rigorosi del metodo di elaborazione EF negli standard di cui sopra, quindi le specifiche di elaborazione locali non sono state unificate per garantire la coerenza. Pertanto, sarebbe utile condurre uno studio sistematico del processo di impronta ambientale. In questo articolo, il metodo sperimentale Box-Behnken della superficie di progettazione-risposta è stato utilizzato per ottimizzare la tecnologia di elaborazione di EF.
Il progetto sperimentale Box-Behnken è un metodo tipicamente utilizzato per ottimizzare i fattori in un processo. I parametri di estrazione possono essere ottimizzati stabilendo la relazione funzionale tra più fattori di adattamento delle equazioni di regressione e valori di effetto. Recentemente, questo metodo è stato ampiamente utilizzato per studiare l’estrazione TCM 5,6,7 e l’elaborazione 9,10,11. Vari studi hanno riportato metodi di preparazione TCM che coinvolgono la lavorazione del sale, la lavorazione del vino e la frittura in padella seguendo un design Box-Behnken, come per Psoraleae fructus 12 trattato con sale, Cnidii fructus13 lavorato con vino e Cinnamomi ramulus14 arrostito. Questo metodo ha ridotto i tempi di test, un’elevata precisione del test ed è adatto per test multifattoriali e multilivello. Il metodo è più semplice del metodo di prova di progettazione ortogonale e più completo del metodo di progettazione uniforme15. Le relazioni ottenute possono determinare il valore previsto di qualsiasi punto di test all’interno dell’intervallo di test, il che rappresenta un grande vantaggio. Un modello di zebrafish può essere utilizzato per verificare se l’EF è meno tossico dopo la lavorazione.
Negli studi di tossicità TCM, il modello zebrafish presenta il duplice vantaggio dell’elevata produttività degli esperimenti sulle cellule e delle somiglianze con gli esperimenti sui roditori16. Questo modello è caratterizzato da piccole dimensioni, alto tasso di deposizione delle uova, breve ciclo di riproduzione e facilità di allevamento. Il modello può essere utilizzato in esperimenti sincroni su larga scala in piastre di coltura cellulare e il dosaggio del farmaco sperimentale è piccolo, il ciclo sperimentale è breve, il costo è basso e l’intero processo sperimentale è facile da osservare e utilizzare17. Gli embrioni di zebrafish sono trasparenti e si sviluppano rapidamente. Pertanto, la tossicità e gli effetti teratogeni dei farmaci sui tessuti viscerali in diversi stadi di sviluppo possono essere osservati direttamente al microscopio18. L’omologia genica tra zebrafish e umani raggiunge l’85%18. La via di trasduzione del segnale del pesce zebra è simile a quella degli esseri umani18. La struttura biologica e la funzione fisiologica del pesce zebra sono molto simili a quelle dei mammiferi18. Pertanto, un modello di zebrafish per test antidroga può fornire animali da esperimento affidabili e pienamente applicabili agli esseri umani19.
In questo studio, abbiamo utilizzato la metodologia della superficie di progettazione-risposta Box-Behnken per ottimizzare la quantità e la temperatura dell’olio di montone e la temperatura di frittura utilizzata nella tecnologia di lavorazione EF, con i contenuti di icariina, epimedina A, epimedina B, epimedina C e baohuoside I come indici di valutazione. Il modello di zebrafish è stato utilizzato per esplorare preliminarmente l’effetto di un estratto di acqua EF sullo sviluppo embrionale del pesce zebra prima e dopo la lavorazione per valutare l’effetto di attenuazione della lavorazione sull’EF.
Variabili indipendenti e determinazione dei loro livelli
La tecnologia di elaborazione EF è descritta solo nell’edizione 2020 della Farmacopea cinese e nelle specifiche locali di elaborazione della medicina cinese pubblicate da 26 province, comuni e regioni autonome in tutto il paese1. La descrizione prevede i seguenti passaggi: prendere l’olio di montone e riscaldarlo per scioglierlo, aggiungere brandelli EF, saltare in padella a fuoco lento fino a quando non è uniforme e lu…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è supportato dal Basic Scientific Research Business Project della Chongqing Academy of Traditional Chinese Medicine (numero di progetto: jbky20200013), dal Performance Incentive Guidance Project degli istituti di ricerca scientifica di Chongqing (numero di progetto: cstc2021jxjl 130025) e dal progetto di costruzione della disciplina chiave della Commissione sanitaria municipale di Chongqing di Chinese Materia Medica Processing.
Acetonitrile | Fisher | 197164 | |
Baohuoside (B ) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20042402 | |
Chromatographic column | Waters Corporation | Symmetry C18 | |
Design Expert software | Stat- Ease Inc., Minneapolis, MN | Trial Version8.0.6.1 | |
Detector | Waters Corporation | 2998 | |
Disintegrator | Hefei Rongshida Small Household Appliance Co., Ltd. | S-FS553 | |
Electronic analytical balance | Mettler-Toledo International Inc. | MS205DU | |
Epimedin A (EA) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-21112118 | |
Epimedin B (EB) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20080403 | |
Epimedin C (EC) | Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd. | MUST-20080310 | |
Ethanol | Chongqing Chuandong Chemical ( Group ) Co., Ltd. | 20180801 | |
Graphpad software | GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA | 6.02 | |
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) | Waters Corporation | 2695 | |
Icariin | Chengdu Glip Biotechnology Co., Ltd. | 21091401 | |
Methanol | Chongqing Chuandong Chemical (Group) Co., Ltd. | 20171101 | |
Microporous membrane | Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd. | 0.22μm | |
Mutton oil | Kuoshan Zhiniu Fresh Food Store | 20211106 | |
Office Excel office software | Microsoft | Office Excel 2021 | |
Pharmacopoeia sieve | Shaoxing Shangyu Huafeng Hardware Instrument Co., Ltd. | R40/3 | |
Pure water machine | Chongqing Andersen Environmental Protection Equipment Co., Ltd. | AT Sro 10A | |
Qualitative filter paper | Shanghai Leigu Instrument Co., Ltd. | 18cm | |
Stereomicroscope | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Stemi 2000 | |
Ultrasonic cleaner | Branson Ultrasonics (Shanghai) Co.,Ltd. | BUG25-12 | |
Zebrafish | China Zebrafish Resource Center (CZRC) | The AB strain |