Summary
여기에서는 자기 공명 유도 집속 초음파를 사용하여 생체 내 마우스 교모세포종 모델에서 초음파 역학 치료를 수행하는 방법을 자세히 설명하는 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
초음파 역학 요법 (SDT)은 초음파 처리 중 감도를 높이기 위해 종양에 초음파 감작제를 사용할 수있는 집속 초음파 (FUS)의 적용입니다. 안타깝게도 교모세포종(GBM)에 대한 현재 임상 치료법이 부족하여 환자들의 장기 생존율이 낮습니다. SDT는 교모세포종을 효과적이고 비침습적이며 종양에 특이적인 방식으로 치료할 수 있는 유망한 방법입니다. 초음파 감작제는 주변 뇌 실질에 비해 종양 세포에 우선적으로 진입합니다. 초음파 감작제의 존재 하에 FUS를 적용하면 반응성 산화 종이 생성되어 세포 사멸이 발생합니다. 이 치료법은 이전에 전임상 연구에서 효과적인 것으로 나타났지만 확립된 표준화된 매개변수가 부족합니다. 전임상 및 임상적 사용을 위해 이 치료 전략을 최적화하기 위해서는 표준화된 방법이 필요합니다. 이 논문에서는 MRgFUS(Magnetic Resonance-Guided FUS)를 사용하여 전임상 교모세포종 설치류 모델에서 SDT를 수행하는 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. MRgFUS는 침습적 수술(예: 개두술) 없이 뇌종양을 특이적으로 표적화할 수 있기 때문에 이 프로토콜의 중요한 기능입니다. 여기에 사용된 벤치탑 장치는 MRI 이미지에서 표적을 클릭하여 3차원의 특정 위치에 초점을 맞출 수 있으므로 표적을 간단하게 선택할 수 있습니다. 이 프로토콜은 연구자들에게 MRgFUS SDT에 대한 표준화된 전임상 방법을 제공하며, 중개 연구를 위한 매개변수를 변경하고 최적화할 수 있는 유연성을 제공합니다.
Introduction
교모세포종(GBM)은 100,000명당 3.21명의 발병률을 보이는 매우 공격적인 뇌종양의 한 형태이며 가장 흔한 악성 뇌종양이다1. 현재 표준 치료에는 외과적 절제, 방사선 및 화학 요법이 포함됩니다2. 종양의 침습성 및 침윤성 특성으로 인해 완전한 종양 절제는 드뭅니다. 종양 가장자리에 잔류 조직이 있으면 종양 재발률이 높고5년 후 생존율이 6% 미만으로 낮다(1).
이러한 예후로 인해 연구자들은 이 치명적인 질병과 싸우기 위한 새로운 치료 옵션을 모색하고 있습니다. 초음파 역학 치료(SDT)는 저강도 집속 초음파(FUS)와 초음파 감작제를 결합하여 표적 세포에서 세포독성 효과를 생성하는 비침습적 치료법입니다3. 예를 들어, 5-아미노레불린산(5-ALA)과 같은 포르피린 기반 초음파 감작제는 종양 세포에 우선적으로 흡수되며 집속 초음파에 노출될 때 반응성 산화종(ROS) 생성을 손상 수준으로 증가시킵니다. 세포에서 과도하게 발현된 ROS 수준은 세포 구조를 손상시키고 세포 사멸을 유발할 수 있습니다. 5-ALA는 종양 세포에 우선적으로 흡수되기 때문에 치료 부위 내의 건강한 조직은 손상되지 않습니다 3,4. 예비 시험관 내 연구에 따르면 많은 암세포가 SDT 처리로 용해되지만 세포 사멸 속도는 세포주에 따라 다릅니다. 예비 생체 내 연구에서도 SDT가 세포사멸을 유발할 수 있음을 확인하면서 유사한 결과가 나왔다5.
이 프로토콜은 벤치탑 FUS 연구 플랫폼을 사용하여 두개내 이식된 교모세포종 세포를 사용하는 설치류 모델의 SDT 치료를 위한 효과적인 기술과 매개변수를 설명하는 것을 목표로 합니다. 연구원은 이 프로토콜을 사용하여 중개 FUS 연구를 위한 SDT를 수행하고 최적화할 수 있습니다.
Protocol
모든 동물 연구는 존스 홉킨스 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 따라 승인 및 수행되었습니다. 흉선 누드 암컷 마우스(연령: 10주)는 상업적 출처에서 얻었다( 자료표 참조). 마스크, 장갑 및 가운 사용을 포함한 모든 생물 안전 레벨 2 (BSL-2) 규정을 준수했습니다.
1. 종양 이식 및 생물 발광 영상
- 연구의 초기 단계에서는 이전에 발표된 보고서6에 따라 두개내 종양 이식을 수행한다.
참고: 이 연구에서는 4μL의 세포 현탁액에 있는 100,000개의 M59 인간 교모세포종 이종이식 세포를 두개골에 3.0mm 깊이로 이식하는 데 사용했습니다. - 치료 전, 이전에 발표된 보고서7에 따라 in vivo 발광 이미징 시스템(재료 표 참조)을 사용하여 각 마우스의 종양 크기를 비침습적으로 정량화한다.
참고: 이것은 초기 종양 이식 후 7일 후인 치료 날짜에 수행되었습니다. - 이미징 정량화를 사용하여 치료를 위해 마우스를 비교 가능한 하위 그룹으로 나눕니다.
참고: 이 연구에서는 (1) 치료되지 않은 종양 보유 마우스(n = 4) 및 (2) SDT를 받는 종양 보유 마우스(n = 4)의 두 하위 그룹이 포함되었습니다. 두 그룹 간에 치료 전 종양 크기에서 통계적으로 유의한 차이는 관찰되지 않았다(p > 0.05).
2. 시술일 설정
- 냉동실에서 5-ALA 염산염( 재료 표 참조)을 제거하고 5-ALA의 마우스 무게 200mg/kg을 칭량합니다(예: 25g 마우스의 경우 5mg의 무게를 잰다). 주변광에서만 하십시오.
알림: 사용하기 전에 모든 장비를 멸균하십시오. - 5-ALA의 총량을 인산염 완충 식염수(PBS)에 용해시켜 각 동물에게 올바른 중량량으로 60mg/mL의 5-ALA 용액을 투여합니다(예: 25g 마우스의 경우 5-ALA 5mg을 83.33μL의 PBS에 용해).
- SDT 테스트 그룹의 각 동물에 대해 적절한 양의 5-ALA 용액을 동물에게 복강 내로 주입합니다(2.1 및 2.2단계에서 계산).
- 5-ALA를 대사하기 위해 동물을 3시간 동안 케이지에 두십시오.
3. 실험 필수 요건 준비
- 물통에 탈이온수(DI)를 채웁니다.
알림: 필요한 물의 양은 연구에 사용된 마우스 수를 기준으로 합니다. - Flow in 및 Flow out 튜브를 초음파 탈기 장치에 부착하고( 재료 표 참조) 탈기 장치를 전원에 연결합니다(1 = ON, 0 = OFF).
- Flow in 및 Flow out 튜브의 다른 쪽 끝을 DI 물통에 넣습니다.
- 탈기 장치를 켜고 45분 동안 작동합니다.
- 새로 가스가 제거된 물을 연구 중에 사용할 밀폐되고 밀봉된 용기 상단에 채웁니다.
- 초음파 젤( 재료 표 참조)을 원뿔형 튜브에 붓고 원심분리기에 넣고 160 x g 에서 5분 동안 회전하여 겔에서 공기를 제거합니다.
알림: 각 동물의 머리에 젤 덩어리를 형성하려면 충분한 젤이 필요합니다.
4. MRgFUS 시스템 설정
- 그림 1(하단 패널)과 같이 배선도를 사용하여 MRgFUS 시스템(재료 표 참조)을 연결합니다.
- 필요한 모든 구성 요소(데스크톱 컴퓨터, 모니터, MRgFUS 플랫폼, 오실로스코프, 증폭기)를 전원에 연결합니다.
- 모든 케이블을 올바른 위치에 연결하십시오.
- BNC 및 동축 케이블을 통해 원하는 변환기를 MRgFUS 플랫폼에 연결한 다음 해당 임피던스 매칭 박스를 올바른 와이어에 연결합니다.
참고: 본 연구에는 515kHz 변환기가 사용되었습니다.
- 모든 장치를 켭니다.
- 데스크톱 컴퓨터 운영 체제에서 FUS 시스템 소프트웨어에 이미 통합된 AUREUS 응용 프로그램을 엽니다.
- 모든 하드웨어 연결을 선택하여 하드웨어를 시스템에 연결하고 구성 요소가 소프트웨어와 통신하는지 확인합니다.
- 드롭다운 메뉴를 선택하고 원하는 변환기를 선택하여 사용되는 변환기를 선택합니다.
5. 초기화
- 팬텀에서 하단 나사를 풀고 캐비티가 넘칠 때까지 탈이온수 및 탈기된 물을 채운 다음 나사를 다시 교체합니다.
- 팬텀을 해당 MRI 베드 위치에 삽입한 다음( 그림 2 참조) MRI 베드를 해당 슬롯의 MRI 크래들에 놓습니다.
- MRI 크래들을 MRI 스캐너의 해당 위치에 놓습니다( 재료 표 참조). 팬텀 MRI 베드가 장애물 없이 MRI 구멍으로 밀어 넣어 팬텀의 고품질 이미지를 얻을 수 있도록 크래들을 조정합니다. 나중에 쉽게 복제할 수 있도록 이 위치를 표시합니다.
알림: 이 위치를 찾으면 나머지 치료 동안 위치가 변경되지 않습니다. 따라서 동물 MRI 배치에 적합한 위치인지 확인하지 않으면 전체 등록을 반복해야 합니다. - 표 1의 설정을 사용하여 팬텀의 MRI 스캔을 수행합니다.
- 자석 구멍에서 크래들을 제거하되 스캐너에 올려 놓으십시오. 크래들에서 팬텀이 포함된 MRI 베드를 제거한 다음 하단의 페그를 올바른 슬롯에 밀어 넣어 팬텀이 있는 베드를 MRgFUS 시스템에 놓습니다.
- 트랜스듀서 암(arm)의 마그네틱 슬롯에 정합 팁을 끼워 팬텀을 향해 아래쪽을 향하도록 합니다( 그림 2 참조).
- 소프트웨어에서 Select a New Home Position(새 홈 위치 선택)을 선택한 다음 Jog Mode On(조그 모드 켜기 )을 선택하여 안내에 초점을 맞춘 찾기를 시작합니다. 조그 모드를 전환한 후 왼쪽, 오른쪽, 위, 아래, 페이지 위 및 페이지 아래 키를 사용하여 변환기 암을 각각 왼쪽, 오른쪽, 앞, 뒤, 위 및 아래 방향으로 수동으로 움직입니다.
- 포인터 끝이 팬텀 상단에 있는 십자 패턴의 중간에 닿을 때까지 3차원 모두에서 포인터를 수동으로 조정합니다( 그림 2 참조).
- 팬텀 MRI 이미지를 컴퓨터에 다운로드하여 선택한 디렉토리의 폴더에 저장한 다음 팬텀 이미지 로드를 선택하여 MRI 이미지를 소프트웨어에 로드합니다. 그러면 축 팬텀 슬라이스가 오른쪽 화면을 채웁니다. 마우스 스크롤 막대를 통해 이러한 조각을 스크롤합니다. 이미지를 길게 클릭한 다음 마우스를 위 또는 아래로 움직여 밝기를 조정합니다.
참고: 폴더에 있는 파일 중 압축되지 않은 DICOM 파일이 아닌 파일이 있는 경우 소프트웨어가 해당 파일을 읽고 가져올 수 없으므로 해당 폴더에서 다른 파일을 제거합니다. - 각각 세 개의 어두운 구멍이 있는 명확한 원이 있는 팬텀 이미지로 스크롤합니다. 팬텀 중앙을 클릭하면 빨간색 원이 나타납니다. 지름이 같고 팬텀의 둘레와 일직선이 될 때까지 원을 클릭하고 끕니다( 그림 2 참조).
- 이 위치의 좌표를 '홈 위치'라고 합니다. L/R, A/P 및 S/I 설정을 클릭하여 저장합니다.
- Jog Mode Off(조그 모드 끄기)를 클릭하고 트랜스듀서 암(arm)에서 정합 팁을 제거한 다음 Exit Focus Finding(초점 찾기 종료)을 선택합니다. 홈 위치를 확인하여 초기화 시퀀스를 완료합니다.
6. SDT를 위한 동물 준비
- 유도 챔버에서 isoflurane-O2 가스 혼합물을 사용하여 마우스를 마취합니다. 마취 유도를 위해 가스 유량을 1.0mL/분으로 설정하고 기화기를 2.0%로 설정하며, 일반적으로 챔버에서 3-5분이 필요합니다(재료 표 참조).
- 발가락을 꼬집어 적절한 진정제를 투여하는지 동물의 상태를 평가합니다. 각막이 건조해지지 않도록 눈에 안과 연고를 바르십시오.
알림: 절차 전반에 걸쳐 마취 깊이를 모니터링하십시오. - 꼬리 정맥을 통해 40μL의 가돌리늄 조영제를 마우스에 주입합니다( 재료 표 참조).
- 두개골 위의 두피를 막고 있는 털은 제모 크림과 전자 면도기를 사용하여 제거합니다.
- 다음 단계를 사용하여 동물을 MRI 침대에 고정합니다( 그림 3 참조).
- 마취를 위해 MRI 베드(그림 3A)의 입구 튜브를 이소플루란 소스에 연결하고 마취 유도를 위해 가스 유량을 1.0mL/분으로, 기화기를 2.0%로 설정합니다. 마취 흡수를 위해 배출 튜브를 숯 필터 용기에 연결합니다.
- 그림 3B와 같이 노즈 콘 피스를 슬롯에 넣습니다. 그림과 같이 노즈 콘과 침대 끝에 있는 바이트 바 구멍을 통해 바이트 바를 밀어 넣고 바이트 가드 끝이 MRI 침대의 열린 웰 위에 떠 있습니다.
- 귀가 정위 귀 바 구멍과 일직선이 되도록 동물을 MRI 침대에 놓고 물린 보호대를 통해 이빨을 잠궈 제자리에 고정합니다. 코뿔을 앞으로 밀어 동물의 위에 오도록 하여 마취를 일정하게 합니다.
- MRI 침대의 양쪽에 있는 구멍을 통해 이어 바를 밀어 넣고 양쪽 이어 바가 쥐의 외이도에 들어갈 수 있을 때까지 동물의 머리를 들어 올립니다.
알림: 동물의 고막이 손상될 수 있으므로 너무 많이 밀지 마십시오. - 동물이 편안한 자세를 취하고 있는지 확인하십시오. 그런 다음 일자 드라이버를 사용하여 MRI 호환 나사를 조여 양쪽 이어 바, 노즈 콘 및 바이트 바를 잠급니다. 이렇게 하면 동물이 제자리에 고정되고 동물이 침대에서 꺼질 때까지 머리가 움직이지 않습니다.
알림: 이 단계에 따라 MRI 침대에서 동물의 위치에 방해가 되지 않는지 확인하십시오. 동물이 움직이면 프로토콜이 얼마나 멀리 떨어져 있는지에 관계없이 전체 설정(6.5단계)을 반복해야 합니다. - 동물이 기다리는 동안 MRI 침대를 따뜻한 열 패드 위에 올려 체온을 유지합니다.
알림: 시술 내내 체온을 모니터링하고 유지하십시오.
- 이소플루란은 플랫폼에 제공된 고정 장치를 사용하여 동물 침대가 FUS 시스템에 고정될 때 치료 전반에 걸쳐 코에 부착된 튜브를 통해 동물에게 지속적으로 공급됩니다.
7. MRI 절차
- 그림 3과 같이 동물이 정위적으로 고정된 상태에서 MRI 침대를 MRI 받침대 끝에 있는 MRI 침대 구멍을 MRI 받침대의 못에 끼워 넣어 이전에 MRI 스캐너에 연결된 MRI 요람에 놓습니다(재료 표 참조). 입구 및 출구 마취 튜브를 MRI 기계의 해당 튜브에 부착합니다.
- 동물이 들어 있는 MRI 거치대를 MRI 구멍에 밀어 넣고 팬텀이 놓인 위치와 동일한 위치를 유지하도록 합니다.
- 위치 파악을 수행하여 동물의 뇌 위치를 확인한 다음 표 2의 MRI 설정을 사용하여 전체 뇌를 포괄하는 조영제 T1 가중 MRI 스캔을 수행합니다.
- MRI 스캔을 각 슬라이스에 대해 하나씩 압축되지 않은 DICOM 파일 집합으로 내보냅니다.
8. 집속 초음파 치료(그림 4)
- 스캔이 완료된 후 MRI 요람에서 동물을 꺼내 침대 앞쪽을 플랫폼 뒤쪽의 해당 못에 끼우고 침대 뒷면을 해당 못에 끼워 플랫폼에 놓습니다.
- 마취를 위해 MRI 베드의 입구 튜브를 이소플루란 소스에 연결하고 마취 유지를 위해 가스 유량을 1.0mL/min으로, 기화기를 2.0%로 설정합니다. 마취 흡수를 위해 배출 튜브를 숯 필터 용기에 연결합니다.
- DICOM 파일 세트를 컴퓨터로 전송하고 현재 스터디의 기본 작업 디렉토리에 있는 폴더에 배치합니다.
참고: 파일 요구 사항은 5.9단계를 참조하십시오. - 소프트웨어에서 기본 초기화 페이지로 이동하여 Guided Focus Finding을 클릭하여 Jog Mode를 켠 다음 Jog Mode On을 클릭합니다.
- 원심분리된 초음파 젤을 동물의 머리에 살짝 바르고 두개골 위의 두피 전체를 덮을 만큼 충분한 젤을 바릅니다.
- DI 및 탈기된 물을 수조에 최대 80%까지 붓고 수조를 플랫폼의 해당 기둥에 끼웁니다.
- 바닥 막이 동물의 머리에 있는 초음파 젤에 닿을 때까지 DI 물로 채워진 수조를 내려 물과 젤 사이의 결합 표면을 형성합니다. 초음파 젤이 수조에 대한 동물의 머리 전체를 덮고 수조와 쥐의 두피 사이의 초음파 젤에 기포가 없는지 확인하십시오.
- 초음파 변환기를 수조에 담그고 변환기 표면에 기포가 형성되지 않도록 합니다.
- 부분적으로 잠긴 트랜스듀서 쪽으로 조그 모드 다운 을 사용하여 트랜스듀서 암을 내리고 트랜스듀서 표면이 잠긴 상태에서 마그네틱 슬롯을 서로 정렬하여 트랜스듀서에 연결합니다.
- Jog Mode(조그 모드)를 끈 다음 초기화 단계에서 수행한 대로 Exit Focused Finding(집중 찾기 종료)을 수행합니다. 이전과 같이 홈 위치를 확인하십시오.
- 치료 탭으로 이동한 다음 화면 상단 중앙에 있는 폴더 아이콘을 클릭하여 조영제 후 T1 가중 MRI 파일을 업로드합니다. 이전에 컴퓨터에 업로드된 DICOM 파일이 포함된 폴더를 선택하고 엽니다. 이 단계는 오른쪽 상단 패널에 있는 모든 DICOM 파일을 자동으로 로드해야 합니다.
- 그런 다음 초음파 처리 모드 탭에서 버스트 또는 연속 파를 선택하여 적절한 치료 모드를 선택합니다. 버스트 모드인 경우 Sonication Settings(초음파 처리 ) 탭에서 버스트 길이, 버스트 기간 및 기간 수를 입력합니다. 이 매개 변수는 각 초음파 처리 위치에 해당합니다. 연속 웨이브 모드인 경우 초음파 처리 지속 시간만 입력합니다.
참고: 이 연구에서는 연속파 모드를 120초 동안 사용했습니다. - 페이지 상단 중앙에 있는 대상 아이콘을 클릭하고 FUS 초점 영역을 조준할 올바른 MRI 슬라이스의 적절한 위치를 선택합니다. 클릭한 위치에 빨간색 원이 있는 밝은 빨간색 사각형이 표시됩니다. 하나 이상의 항목을 선택할 수 있습니다.
- MRI 이미지의 왼쪽에는 선택한 초점 영역의 3D 좌표로 채워지는 테이블이 있습니다. 표의 마지막 열에는 원하는 압력 또는 강도 수준을 얻는 데 사용되는 각 변환기에 대해 별도로 계산할 수 있는 각 초점에서 초음파 처리할 전력 수준을 입력합니다. 표의 각 초점을 클릭하여 확인하면 좌표가 강조 표시되고 이미지의 해당 초점 영역이 파란색으로 바뀝니다.
알림: 변환기 데이터시트를 참조하여 표에 입력된 전력 수준을 압력 또는 강도로 변환하는 방법을 결정하십시오. - 모든 초점 영역이 만족스러우면 모션 테스트를 선택합니다. 이렇게 하면 소프트웨어가 변환기를 모든 초점으로 이동하여 이동이 가능한지 확인하라는 메시지가 표시됩니다. 확인 후 소프트웨어에 모션 테스트 완료가 표시됩니다. 오류가 발생하면 초점 영역이 변환기 모터의 3D 축에 맞도록 조정합니다.
- 준비가 되면 초음파 처리 시작 을 선택하여 초음파 처리 프로토콜을 시작하고 변환기를 이동하고 선택한 각 초점 영역에 올바른 FUS 매개 변수를 적용합니다.
- 초음파 처리 프로토콜이 완료되면 변환기 암에서 변환기를 분리하고 플랫폼에서 수조를 제거한 다음 동물의 두피에서 초음파 젤을 닦아냅니다.
- 물린 부분과 이어 바의 나사를 풀고 MRI 침대에서 동물을 꺼낸 다음 동물이 마취에서 깨어날 때까지 따뜻한 패드 위에 동물을 놓습니다. 이 시점에서 동물을 케이지로 되돌려 보냅니다.
- 후속 동물의 경우 섹션 6부터 시작하여 동일한 프로토콜을 반복합니다.
- 원하는 동물을 치료한 후에는 동물이 만지는 모든 표면을 70% 에탄올로 청소하십시오( 재료 표 참조).
- 소프트웨어를 종료한 다음 각 장비를 종료하고 끕니다.
9. 치료 후 단계
- 처리 후 24시간 측정하는 생물 발광에 대해 섹션 1의 IVIS(in vivo imaging system) 프로토콜을 반복합니다. 치료 효과를 분석하려면 치료 전과 후의 생물 발광 기록을 비교하여 치료군과 치료하지 않은 군 모두의 성장률을 결정합니다.
- 6.4단계와 동일한 설정을 사용하여 후속 MRI 스캔을 수행합니다. 조영제 강화 스캔을 사용하여 종양 영역의 평균 그레이스케일 강도를 비교하거나 조영제가 커버하는 총 부피를 계산하여 치료 전후 종양 부피의 차이를 확인합니다.
Representative Results
치료 후 24시간 동안 SDT로 치료한 동물의 종양 크기가 감소합니다.
SDT 처리 당일, 대조군과 처리군(각각 N=4)에 대한 원래의 평균 생물발광 신호는 각각 2.0 x 10 6 ± 3.1 x 10 6 및 2.3 x 10 6 ± 1.3 x 10 6 p/s/cm2/sr이었다. 두 그룹 간의 치료 전 종양 크기에 해당하는 평균 생물 발광 값은 통계적으로 유의하지 않았습니다(p=0.89). SDT 후 처리군의 평균 생물발광 신호는 3.57 x 10 6 ± 2.3 x 10 6 24시간인 반면, 대조군의 생물발광 신호는 5.5 x 10 6 ± 8.2 x 10 6 p/s/cm2/sr로 증가하였다. 그림 5에서 볼 수 있듯이 이는 기하급수적 성장(p=0.08)을 가정할 때 각각 83.4% ± 78% 및 172% ± 34%의 성장률에 해당합니다. 처리한 4마리의 동물 중 3마리는 대조군에 비해 처리 후 성장률이 낮았다. 치료군에는 대조군과 비슷한 성장을 보인 특이치가 하나 있었는데, 이는 편차가 왜곡되었습니다.
또한, 동물은 종양의 치료 전후 비교를 위해 치료 다음날 조영제 강화 MR 영상을 받았습니다. 종양 크기의 추정치로 치료 후 종양에 얼마나 많은 조영제가 들어가는지 측정하기 위해 각 동물에 대한 각 MRI 절편에 걸쳐 종양에서 조영제의 평균 그레이스케일 강도를 수행했습니다. 치료 전, 대조군과 치료군 간의 평균 종양 회색조 강도는 비슷했다. 평균적으로 이 그레이스케일 강도는 대조군에서 치료군보다 더 큰 크기로 증가했지만 유의하지는 않았습니다(p =0.47). 이 데이터는 표 2에서 볼 수 있습니다. 이러한 결과의 높은 변동성은 잠재적으로 MRI가 치료 후 24시간 동안만 촬영되었다는 사실에 기인하며, 이 시점에서 SDT의 치료 잠재력은 이제 막 발생하기 시작했습니다. 그렇다 하더라도, 그림 6 은 SDT에 의해 생성된 병변의 예를 보여준다.
그림 1: FUS 시스템 설정 (맨 위로) 레이블이 지정된 구성 요소가 있는 MRgFUS 시스템. (전면) 1. 플랫폼. 2. 축선에 의하여 자동화되는 변형기 팔. 3. FUS 변환기. 4. 수조. 5. MRI 침대. 6. 모니터. 7. 변환기 임피던스 매칭 박스. 8. 전력 증폭기 상자. 9. 함수 발생기. 10. 함수 발생기 채널 1 BNC 포트. 11. 데스크탑 컴퓨터. (하단) 다음 연결이 있는 색상으로 구분된 배선 회로도가 있는 MRgFUS 시스템. (뒤로) 1. 전원 코드. 2. HDMI를 데스크탑 HDMI로 모니터링합니다. 3. 포트 B USB B 대 데스크탑 USB A. 4. 오실로스코프 LAN 이더넷-데스크탑 이더넷. 5. 데스크탑 이더넷에 대한 모션 인터페이스 이더넷. 6. 오실로스코프 보조 입력/출력 BNC-AWG 입력 BNC. 7. 오실로스코프 채널 1 (전면) BNC - SYNC BNC. 8. RF 입력 동축에 어울리는 상자 산출 BNC. 9. RF 출력 동축에서 동축으로 일치하는 상자. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 팬텀 등록 (A) 팬텀 등록 중 시스템 설정 및 소프트웨어. (B) 팬텀 등록 화면의 스크린샷으로, 빨간색 원은 축 단면의 선택된 둘레입니다. (C) MRI 침대에 놓인 팬텀, 평면도. (D) 팬텀의 측면도, 빨간색 선은 C의 원에 해당하는 축 슬라이스에 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 동물 배치. (A) 다양한 부품이 표시된 MRI 침대 및 요람: 1. MRI 요람. 2. 정위 MRI 침대. 3. 이어 바. 4. 바이트 바. 5. 노즈 콘. 6. MRI 침대 못 구멍. 7. 이소플루란 마취 튜브. (B) RF 코일(주황색)을 사용하여 MRI 베드에 마우스를 배치하고 크래들에 배치한 그림을 나타냅니다(Biorender 2022 템플릿을 사용하여 수정된 그림). (C) FUS 치료 중 MRI 침대에 마우스를 놓은 것을 나타내는 그림(Biorender 2022 템플릿을 사용하여 수정된 그림). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 초점 선택. 단일 동물에서 초음파 처리 포인트 선택의 예. 각 열은 각 슬라이스가 근위부(슬라이스 1)에서 원위부(슬라이스 5) 방향으로 0.5mm인 T1 가중 조영제 후 MRI 슬라이스를 나타냅니다. 종양 경계는 수동으로 분할되어 빨간색 (1 행)으로 윤곽선이 그려져 있으며 해당 초음파 처리 위치 (2 행)는 연한 녹색 사각형 (초점 최대 중심)과 파란색 원 (최대 초점 둘레의 절반)으로 표시됩니다. 각 위치는 2 분 동안 초음파 처리되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: SDT 이후의 성장률. 측정된 발광을 기반으로 두개내 M59 종양이 있는 치료 및 치료되지 않은(대조) 동물에서 SDT 치료 전-24시간 후 교모세포종 종양의 성장률. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 유의성을 결정하기 위해 2표본 학생의 T-검정을 수행했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: SDT로 생성된 병변. 조영제 전후 강화 SDT에 의해 생성된 종양의 병변을 보여주는 대표적인 축 절편을 특징으로 하는 동물 모델에서 T1 가중 MRI 스캔을 강화합니다. (왼쪽) SDT 치료 전에 촬영한 MRI 스캔, 종양 윤곽선이 빨간색으로 표시됨. (가운데) FUS 초점 선택: 최대 압력은 연한 파란색 원으로 표시되고 절반 최대 압력 영역은 파란색 원으로 표시됩니다. (오른쪽) SDT 후 MRI 스캔에서 종양의 윤곽선이 빨간색으로 표시됩니다. SDT로 생성된 병변과 이식을 위한 주사기 구멍이 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 순서 | T1 시리즈 |
| 반복 시간 | 3000밀리초 |
| 에코 시간 | 30밀리초 |
| 슬라이스 두께 | 0.5의 mm |
| 슬라이스 수 | 25 |
| 픽셀 간격 | 0.187mm x 0.187mm |
| 획득 매트릭스 | 133 엑스 133 |
| 평균 | 4 |
표 1: MRI 설정.
| 제어 | SDT 그룹 | p-값 | |
| 전처리 | 7.49 엑스 103 ± 2.2 엑스 103 | 7.48 엑스 103 ± 1 엑스 103 | 0.99 |
| 후처리 | 8.79 엑스 103 ± 7.7 엑스 102 | 7.95 엑스 103 ± 1.1 엑스 103 | 0.33 |
| 퍼센트 차이 | 16% ± 16% | 7% ± 12% | 0.47 |
표 2: 조영제 강화 T1 가중 MRI 그레이스케일.
Discussion
교모세포종 환자에게는 새로운 치료법과 효과적인 치료법이 필요하다. 이 프로토콜은 현재 임상 번역을 위해 광범위한 조사를 진행 중인 교모세포종에 대한 전임상 FUS 매개 치료법을 설명했습니다. SDT는 흥미로운 잠재력을 가지고 있지만 전임상 환경에서 이해하고 최적화해야 할 것이 여전히 많습니다.
이 프로토콜의 가장 중요한 구성 요소 중 하나는 MR 유도 FUS를 활용하여 종양을 표적으로 삼아 효능을 극대화하는 것입니다. 팬텀을 사용하여 축 MRI 슬라이스의 각 픽셀에 좌표를 할당할 수 있는 3D 좌표 공간을 생성할 수 있습니다. 그런 다음 MR 이미지에서 초음파 처리 위치를 선택하는 간단한 절차를 통해 변환기가 조준할 위치를 알려줍니다. 사용되는 전임상 FUS 시스템은 매우 다재다능하며 영상 확인 없이는 표적화하기 어려운 더 깊은 종양을 포함하여 종양과 같은 특정 병리의 위치를 표적화해야 할 때 적용할 수 있습니다. 가돌리늄을 조영제로 사용하면 종양을 명확하게 시각화할 수 있어 사용자가 표적을 선택할 때 정보에 입각한 결정을 내릴 수 있습니다. SDT가 다른 많은 치료법에 비해 갖는 장점은 종양 특이적 치료법이라는 것입니다. 저강도 FUS는 종양 조직만을 표적으로 삼아야 하며, 건강한 뇌 실질은 상대적으로 건드리지 않아야 한다 3,8.
이 실험의 결과는 이 프로토콜의 장점이 SDT에 대한 문헌의 다른 발견과 유사한 치료 결과로 이어질 수 있음을 강조합니다. 그림 5 는 치료일 후 24시간 이내에 치료된 코호트에서 종양 성장이 느려졌음을 보여줍니다. 이 작은 표본 크기를 사용하면 중요하지 않지만 동물 수가 많을수록 유의성이 발생할 수 있습니다. 이러한 종양 성장 지연은 Wu et al.(2019)의 선구적인 논문에서 밝혀진 것과 유사한데, 이 논문은 치료된 동물에서 시간이 지남에 따라 종양 성장이 느려지고 생존 시간이 증가한 것으로 나타났다9.
이 프로토콜을 설계할 때 고려 사항에는 동물 균주, 종양 유형 및 초음파 감작제 선택이 포함되었습니다. 흉선성 누드 마우스는 여러 가지 이유로 이 프로토콜에 선택되었습니다. 첫째, 누드 마우스는 머리카락이 없기 때문에 감쇠를 방지하기 때문에 초음파 처리가 더 쉽습니다. 또한 면역 체계가 없기 때문에 환자 유래 이종이식(PDX)을 이식할 수 있으므로 종양 모델이 임상 상황과 더 유사합니다. 무흉선 모델을 사용하는 것의 단점은 면역 체계를 특성화할 수 없기 때문에 SDT에서 생성된 면역 반응은 이 연구에서 측정되지 않는다는 것입니다10. 선택된 종양 라인은 공격적이고 빠르게 성장하는 PDX 라인입니다. 종양의 확립을 확인해야 하지만 종양 부담이 두개골 반구를 채우지 않아야 하기 때문에 치료 시간이 매우 중요합니다. 세포주마다 전임상 실험을 위한 최적의 크기의 종양을 얻기 위해 서로 다른 배양 시간이 필요합니다. 이 프로토콜에서 5-ALA는 교모세포종 종양에서 우선적으로 흡수되기 때문에 초음파감작제로 사용되었으며, 이는 이전 실험(미공개 데이터)에서 이 세포주에 대해 시험관 내에서 확인되었습니다. 다른 초음파 감작제를 치환하고 테스트하여 효능 및 안전성에 가장 적합한 화합물을 결정할 수 있습니다. 마지막으로, 치료는 5-ALA 주사 후 3시간 후에 시작되었는데, 이는 이전 문헌에서 이 주사 용량(5)이 최적의 시기임을 보여주었다.
이 프로토콜에서 선택된 FUS 파라미터(각 타겟 위치에서 515kHz에서 2분 동안 10W/cm2)는 이전 문헌 및 초기 실험 4,9의 검토를 기반으로 결정되었습니다. 전체 종양에 걸쳐 ROS 효과를 생성하기 위해 전체 종양을 덮는 초음파 처리 지점의 그리드를 선택했습니다. 여기에 사용된 강도는 다른 간행물보다 높지만, 짧은 시간 범위에서, 최대 25W/cm2의 강도가 심각한 부작용 없이 마우스 모델에서 성공적으로 사용되었기 때문에, 이는 온도와 관련된 어떠한 악영향도 초래하지 않을 것으로 예상된다11. 중요한 것은 표준화되거나 최적화된 FUS 파라미터 세트가 문헌에 발표되지 않았다는 것입니다. 따라서 여기에 보고된 특정 값을 조정하여 최적의 매개변수 세트를 결정할 수 있으며, 이를 통해 안전성을 유지하면서 종양 조직을 최대한 줄일 수 있습니다. 또한 세포주에 따라 혈관 형성 및 저산소증 수준이 다르기 때문에 이 치료법을 조정해야 할 수도 있습니다. SDT 치료 후 24시간 이내에 종양 성장이 전반적으로 감소한 것으로 나타났지만(그림 5), 이 치료의 최대 효과를 결정하기 위해서는 파라미터를 최적화하고 더 많은 동물을 테스트해야 합니다. 치료 후 MRI 스캔에서는 건강한 조직에서 FUS 치료로 인해 생성된 병변이 나타나지 않으며 그 효과는 종양 조직에 국한되어 있습니다(그림 6). 또한 SDT를 혈액-뇌장벽의 일시적인 투과와 같은 다른 FUS 기술과 결합하여 종양에서 5-ALA 흡수를 극대화할 수 있는 기회도 있다12. 이 프로토콜은 구조적 수준에서 안전성과 효능을 확인하기 위해 다양한 조직학 기술을 수행함으로써 추가로 보완될 수 있습니다. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 수행하여 구조적 손상 또는 종양 손상13을 확인할 수 있으며, 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소 dUTP 닉엔드 라벨링(TUNEL) 염색을 수행하여 세포 사멸14을 확인할 수 있다. 어쨌든, 이 프로토콜은 SDT로 치료된 종양과 치료되지 않은 종양의 성장률을 비교하고 초음파 처리 전후의 종양 절편을 비교함으로써 명백한 치료 후 24시간에도 변화가 눈에 띄는 안전한 종양별 치료를 제공합니다.
모든 프로토콜에는 항상 고려해야 할 단점이나 한계가 있습니다. 현재 프로토콜의 주요 한계는 시간과 비용입니다. 한편, 이 프로토콜의 장점 중 하나는 자동화된 집중 조준입니다. 이 집중 절차를 수행하려면 각 개별 동물에 대해 MRI 스캔을 수행하여 종양의 표적화가 정확한지 확인해야 하며, 이 과정은 시간과 비용이 많이 소요될 수 있습니다. 또한 원하는 초점의 수에 따라 이 프로토콜을 수행하는 데 걸리는 시간이 몇 마리의 동물에 대해서도 몇 시간이 걸릴 수 있으므로 실험 동물의 수가 줄어들 수 있습니다. 이러한 단점에도 불구하고, 이 표적 비침습적 프로토콜은 개복 수술 옵션과 비교할 때 여전히 실현 가능한 선호 사항으로 남아 있습니다.
결론적으로, 이 프로토콜은 전임상 마우스 모델에서 건강한 신경 조직을 유지하면서 치료 후 24시간 이내에 뇌의 종양 성장을 줄이는 SDT 치료의 능력을 보여주었습니다. 이 치료법을 임상적으로 적합하게 만들기 위해서는 SDT의 효과에 대한 연구와 ROS 생성을 증가시키기 위한 다양한 매개변수의 최적화가 필요합니다. SDT를 비침습적 치료 모델로 사용하기 위한 새로운 방법을 모색해야 합니다.
Disclosures
저자는 이 연구가 잠재적인 이해 상충으로 해석될 수 있는 상업적 또는 재정적 관계가 없는 상태에서 수행되었음을 선언합니다. 아미르 만바치(Amir Manbachi)는 BK Medical(GE Healthcare), Neurosonics Medical에서 강의와 컨설팅을 담당하고 있으며, 특허 출원 중인 다수의 FUS 기술을 발명한 사람입니다. 베티 타일러(Betty Tyler)는 미국 국립보건원(NIH)으로부터 연구 자금을 지원받고 있으며, Accelerating Combination Therapies*의 공동 소유주입니다. Ashvattha Therapeutics Inc.는 또한 그녀의 특허 중 하나를 라이선스했으며 그녀는 Peabody Pharmaceuticals(*지분 또는 옵션 포함)의 주주입니다.
Acknowledgments
저자들은 미국 국립과학재단(NSF)의 STTR Phase 1 Award(#: 1938939), ASME DARPA(Defense Advanced Research Projects Agency) Award(#: N660012024075), 그리고 NIH(National Institutes of Health) NCATS(National Center for Advancing Translational Sciences)가 관리하는 Johns Hopkins Institute for Clinical and Translational Research(ICTR)의 Clinical Research Scholars Program(KL2)의 자금 지원을 인정합니다. 세포는 Mayo Foundation for Medical Education and Research에서 구입하여 제공했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| 1 mL Syringes | BD | 309597 | |
| 10 µL Hamilton syringe | Hamilton Company | 49AL65 | |
| 10 µL Pipette tips | USAScientific | ||
| 1000 mL Flask | Corning | MP-34514-25 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | CLS430791 | |
| 200 Proof ethanol | PharmCo | 111000200 | |
| 5 mL pipettes | Falcon | 357543 | |
| 50 mL Conical tubes | Corning | 430290 | |
| 500 mL filter | Corning | 431097 | |
| 5-Aminolevulinic acid hydrochloride | Research Products International | A11250 | |
| 7T PET-MR system | Bruker | Biospec 70/30 | |
| Aluminum foil | Reynolds Brand | ||
| Amplifier | FUS Instruments | 2175 | |
| Athymic nude mice | Charles River Laboratories | Strain Code 490 | |
| Bone drill | Foredom | HP4-917 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004261 | |
| Charcoal isoflourane waste container | Patterson scientific | 78909457 | |
| Computer | FUS Instruments | 2269 | |
| Cover glass | Fisherbrand | 12-545J | |
| Desktop monitor | ASUS | VZ239H | |
| D-Luciferin | Gold Biotechnology | LUCK-1G | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Electronic shaver | Wahl | 93235-002 | |
| Eppendorf tubes | Posi-Click | 1149K01 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Formalin | Thermo Fisher Scientific | SF100-20 | |
| Function generator | Siglent | QS0201X-E01B | |
| Gadolinium contrast agent (Gadavist) | McKesson Corporation | 2068062 | |
| Gauze | Henry Schein | 101-4336 | |
| Heat lamp | |||
| Heat pad | Kent Scientific | RT-0501 | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-12 | |
| Induction chamber | Patterson scientific | 78933388 | |
| Isofluorane vaporizer | Patterson scientific | 78916954 | |
| Isoflurane | Covetrus | 29405 | |
| Isoflurane system | Patterson Scientific | 78935903 | |
| IVIS spectrum | Perkin Elmer | 124262 | |
| Lightfield microscope | BioTek | Cytation 5 | |
| Nair | Church and Dwight Co. | 42010553 | |
| Ophthalmic ointment | Puralube vet ointment | ||
| P-20 pippette | Rainin | 17008650 | |
| Patient derived xenographs | Mayo Clinic | M59 | |
| Penicillin/Streptomyosin | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | 70-011-069 | |
| Pippetter | Drummond | 4-000-101 | |
| Povidone-iodine | Covetrus | PI050CV | |
| RK-50 MRgFUS system | FUS Instruments | 2182 | |
| Scale | |||
| Scalpel blade | Covetrus | 7319 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Screwdriver set | Jakemy | JM-8160 | |
| Skin marker | Time Out | D538,851 | |
| Staple remover | MikRon | ACR9MM | |
| Stapler | MikRon | ACA9MM | |
| Staples | Clay Adams | 427631 | |
| Stereotactic frame | Kopf Instruments | 5000 | |
| Stereotactic MRI prototype plastic imaging fixture | FUS Instruments | ||
| T-25 culture flask | Corning | 430641U | |
| Transducer and matching box | FUS Instruments | T515H750-118 | |
| Ultrasonic degasser | FUS Instruments | 2259 | |
| Ultrasound gel | ParkerLabs | 01-08 | |
| Water bath | FUS Instruments | ||
| Xylazine | Covetrus | 1XYL006 |
References
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