Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll, das detailliert beschreibt, wie die sonodynamische Therapie in einem in vivo Maus-Glioblastommodell mit Magnetresonanz-gesteuertem fokussiertem Ultraschall durchgeführt werden kann.
Abstract
Die sonodynamische Therapie (SDT) ist eine Anwendung von fokussiertem Ultraschall (FUS), die es ermöglicht, Tumore mit einem Sonosensibilisator auf eine erhöhte Empfindlichkeit während der Beschallung vorzubereiten. Leider fehlen derzeit klinische Behandlungen für das Glioblastom (GBM), was zu niedrigen Langzeitüberlebensraten der Patienten führt. SDT ist eine vielversprechende Methode, um GBM effektiv, nicht-invasiv und tumorspezifisch zu behandeln. Sonosensibilisatoren dringen bevorzugt in Tumorzellen ein als in das umgebende Hirnparenchym. Die Anwendung von FUS in Gegenwart eines Sonosensibilisators erzeugt reaktive oxidative Spezies, die zu Apoptose führen. Obwohl sich diese Therapie bereits in präklinischen Studien als wirksam erwiesen hat, fehlt es an etablierten standardisierten Parametern. Standardisierte Methoden sind notwendig, um diese therapeutische Strategie für den präklinischen und klinischen Einsatz zu optimieren. In dieser Arbeit beschreiben wir das Protokoll zur Durchführung von SDT in einem präklinischen GBM-Nagetiermodell unter Verwendung von Magnetresonanz-gesteuerter FUS (MRgFUS). MRgFUS ist ein wichtiges Merkmal dieses Protokolls, da es ein spezifisches Targeting eines Hirntumors ermöglicht, ohne dass invasive Operationen (z. B. Kraniotomie) erforderlich sind. Das hier verwendete Tischgerät kann durch Anklicken eines Ziels auf einem MRT-Bild eine bestimmte Stelle dreidimensional fokussieren, was die Zielauswahl zu einem unkomplizierten Prozess macht. Dieses Protokoll bietet Forschern eine standardisierte präklinische Methode für MRgFUS SDT mit der zusätzlichen Flexibilität, Parameter für die translationale Forschung zu ändern und zu optimieren.
Introduction
Das Glioblastom (GBM) ist eine Form des hochaggressiven Hirntumors, der mit einer Inzidenz von 3,21 pro 100.000 Menschen der häufigste bösartige Hirntumor ist1. Der derzeitige Behandlungsstandard umfasst chirurgische Resektion, Bestrahlung und Chemotherapie2. Aufgrund der invasiven und infiltrativen Natur des Tumors ist eine vollständige Tumorresektion selten. Restgewebe an den Tumorrändern führt zu einer hohen Tumorrezidivrate und einer niedrigen Überlebensrate von weniger als 6 % nach 5 Jahren1.
Aufgrund dieser Prognose erforschen Forscher neue Therapiemöglichkeiten, um diese tödliche Krankheit zu bekämpfen. Die sonodynamische Therapie (SDT) ist eine nicht-invasive Behandlung, bei der fokussierter Ultraschall niedriger Intensität (FUS) und Sonosensibilisatoren kombiniert werden, um eine zytotoxische Wirkung in den Zielzellen zu erzielen3. So werden beispielsweise auf Porphyrin basierende Sonosensibilisatoren wie 5-Aminolävulinsäure (5-ALA) bevorzugt von Tumorzellen aufgenommen und erhöhen die Produktion reaktiver oxidativer Spezies (ROS) auf ein schädliches Niveau, wenn sie fokussiertem Ultraschall ausgesetzt werden. Überexprimierte ROS-Konzentrationen in Zellen können zelluläre Strukturen schädigen und Apoptose auslösen. Da 5-ALA bevorzugt von Tumorzellen aufgenommen wird, bleibt gesundes Gewebe innerhalb der Behandlungsregion unversehrt 3,4. Vorläufige In-vitro-Studien haben gezeigt, dass viele Krebszellen durch SDT-Behandlung lysiert werden, obwohl die Rate des Zelltods von der Zelllinie abhängt. Vorläufige In-vivo-Studien liefern ähnliche Ergebnisse und bestätigen, dass SDT Apoptoseauslösen kann 5.
Dieses Protokoll zielt darauf ab, effektive Techniken und Parameter für die SDT-Behandlung von Nagetiermodellen mit intrakraniell implantierten GBM-Zellen unter Verwendung einer FUS-Forschungsplattform zu beschreiben. Forscher können dieses Protokoll verwenden, um SDT für die translationale FUS-Forschung durchzuführen und zu optimieren.
Protocol
Alle Tierstudien wurden in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Johns Hopkins University genehmigt und durchgeführt. Athyme nackte weibliche Mäuse (Alter: 10 Wochen) wurden aus kommerziellen Quellen bezogen (siehe Materialtabelle). Alle Vorschriften der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) wurden eingehalten, einschließlich der Verwendung von Masken, Handschuhen und Kitteln.
1. Tumorimplantationen und Biolumineszenz-Bildgebung
- In der Anfangsphase der Studie ist eine intrakranielle Tumorimplantation durchzuführen, die einem zuvor veröffentlichten Berichtfolgt 6.
HINWEIS: In dieser Studie wurden 100.000 menschliche M59-GBM-Xenotransplantatzellen in 4 μl Zellsuspension für die Implantation in einer Tiefe von 3,0 mm in den Schädel verwendet. - Quantifizieren Sie vor der Behandlung die Tumorgröße in jeder Maus nichtinvasiv mit einem In-vivo-Lumineszenz-Bildgebungssystem (siehe Materialtabelle) gemäß einem zuvor veröffentlichten Bericht7.
HINWEIS: Dies geschah am Tag der Behandlung, 7 Tage nach der ersten Tumorimplantation. - Mit Hilfe der bildgebenden Quantifizierung werden die Mäuse für die Behandlung in vergleichbare Untergruppen eingeteilt.
ANMERKUNG: In dieser Studie wurden zwei Untergruppen eingeschlossen: (1) unbehandelte tumortragende Mäuse (n = 4) und (2) tumortragende Mäuse, die sich einer SDT unterzogen (n = 4). Es wurde kein statistisch signifikanter Unterschied in der Tumorgröße vor der Behandlung zwischen den beiden Gruppen beobachtet (p > 0,05).
2. Einrichtung des Behandlungstages
- 5-ALA-Hydrochlorid (siehe Materialtabelle) aus dem Gefrierschrank nehmen und 200 mg/kg Mausgewicht 5-ALA abwiegen (z. B. für eine 25 g Maus 5 mg abwiegen). Tun Sie dies nur bei Umgebungslicht.
HINWEIS: Sterilisieren Sie alle Geräte vor dem Gebrauch. - Die Gesamtmenge an 5-ALA wird in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gelöst, so dass jedem Tier eine 60 mg/ml-Lösung von 5-ALA mit der richtigen Gewichtsdosis verabreicht wird (z. B. für eine 25-g-Maus 5 mg 5-ALA in 83,33 μl PBS auflösen).
- Für jedes Tier in der SDT-Testgruppe wird die richtige Menge der Lösung von 5-ALA intraperitoneal in das Tier injiziert (berechnet in den Schritten 2.1 und 2.2).
- Lassen Sie die Tiere 3 Stunden in ihren Käfigen, um das 5-ALA zu verstoffwechseln.
3. Vorbereitung der Voraussetzungen für Versuche
- Füllen Sie einen Behälter mit deionisiertem Wasser (DI).
HINWEIS: Die benötigte Wassermenge basiert auf der Anzahl der Mäuse, die in der Studie verwendet wurden. - Befestigen Sie die Flow-In- und Flow-Out-Rohre am Ultraschall-Entgaser (siehe Materialtabelle) und schließen Sie den Entgaser an die Stromversorgung an (1 = ON, 0 = OFF).
- Stecken Sie das andere Ende der Flow-In - und Flow-Out-Schläuche in den DI-Wasserbehälter.
- Schalten Sie den Entgaser ein und lassen Sie ihn 45 Minuten lang laufen.
- Füllen Sie das frisch entgaste Wasser bis zum Oberteil eines luftdichten, verschlossenen Behälters, der während der Studie verwendet werden soll.
- Gießen Sie Ultraschallgel (siehe Materialtabelle) in ein konisches Röhrchen, geben Sie es dann in eine Zentrifuge und schleudern Sie es 5 Minuten lang bei 160 x g , um dem Gel Luft zu entziehen.
HINWEIS: Es wird genügend Gel benötigt, um einen Klecks Gel auf dem Kopf jedes Tieres zu bilden.
4. Einrichtung des MRgFUS-Systems
- Schließen Sie das MRgFUS-System (siehe Materialtabelle) anhand des Schaltplans an, wie in Abbildung 1 (untere Tafel) zu sehen ist.
- Schließen Sie alle notwendigen Komponenten (Desktop-Computer, Monitor, MRgFUS-Plattform, Oszilloskop, Verstärker) an die Stromversorgung an.
- Schließen Sie alle Kabel an die richtigen Stellen an.
- Verbinden Sie den gewünschten Wandler über die BNC- und Koaxialkabel mit der MRgFUS-Plattform und verbinden Sie dann die entsprechende Impedanzanpassungsbox mit den richtigen Drähten.
ANMERKUNG: Für die vorliegende Studie wurde ein 515-kHz-Wandler verwendet.
- Schalten Sie alle Geräte ein.
- Öffnen Sie auf dem Betriebssystem des Desktop-Computers die AUREUS-Anwendung, die bereits in die FUS-Systemsoftware integriert ist.
- Wählen Sie Alle Hardware verbinden aus, um die Hardware mit dem System zu verbinden und sicherzustellen, dass die Komponenten mit der Software kommunizieren.
- Wählen Sie den verwendeten Wandler aus, indem Sie das Dropdown-Menü auswählen und den gewünschten Wandler auswählen.
5. Initialisierung
- Lösen Sie die untere Schraube vom Phantom und füllen Sie den Hohlraum mit deionisiertem und entgastem Wasser, bis es überläuft, und setzen Sie dann die Schraube wieder ein.
- Setzen Sie das Phantom in die entsprechende Position des MRT-Bettes ein (siehe Abbildung 2) und legen Sie das MRT-Bett dann in die MRT-Halterung im entsprechenden Schlitz.
- Platzieren Sie die MRT-Halterung an der entsprechenden Stelle im MRT-Scanner (siehe Materialtabelle). Stellen Sie die Halterung so ein, dass das Phantom-MRT-Bett ohne Hindernisse in die MRT-Bohrung gleiten kann, um ein qualitativ hochwertiges Bild des Phantoms zu erhalten. Markieren Sie diesen Speicherort, damit er in Zukunft leicht repliziert werden kann.
HINWEIS: Sobald diese Stelle gefunden wurde, wird sie für den Rest der Behandlung nicht mehr geändert. Stellen Sie daher sicher, dass es sich um einen geeigneten Ort für die MRT-Platzierung des Tieres handelt, da sonst die gesamte Registrierung wiederholt werden muss. - Nehmen Sie einen MRT-Scan des Phantoms mit den Einstellungen in Tabelle 1 vor.
- Entfernen Sie die Halterung aus der Magnetbohrung, aber lassen Sie sie auf dem Scanner. Nehmen Sie das MRT-Bett mit dem Phantom aus der Halterung und stellen Sie das Bett mit dem Phantom auf das MRgFUS-System, indem Sie den Stift an der Unterseite in den richtigen Schlitz schieben.
- Setzen Sie die Registrierungsspitze so auf die magnetischen Schlitze am Wandlerarm, dass sie nach unten in Richtung des Phantoms zeigt (siehe Abbildung 2).
- Wählen Sie in der Software "Neue Ausgangsposition auswählen" und dann "Jog-Modus ein ", um mit der geführten fokussierten Suche zu beginnen. Nachdem der Jog-Modus umgeschaltet wurde, verwenden Sie die Tasten links, rechts, oben, unten, Bild auf und Bild-ab, um den Wandlerarm manuell in die Richtung links, rechts, vorwärts, rückwärts, oben und unten zu bewegen.
- Stellen Sie den Zeiger manuell in allen drei Dimensionen ein, bis die Spitze des Zeigers die Mitte des Kreuzmusters berührt, das auf der Oberseite des Phantoms liegt (siehe Abbildung 2).
- Laden Sie die Phantom-MRT-Bilder auf den Computer herunter und legen Sie sie in einem Ordner im ausgewählten Verzeichnis ab, und laden Sie dann die MRT-Bilder in die Software, indem Sie Phantombilder laden auswählen. Die axialen Phantomschichten bevölkern dann den Bildschirm auf der rechten Seite. Scrollen Sie mit der Bildlaufleiste der Maus durch diese Slices. Passen Sie die Helligkeit an, indem Sie auf das Bild klicken und es gedrückt halten und dann die Maus nach oben oder unten bewegen.
HINWEIS: Wenn es sich bei einer der Dateien im Ordner nicht um unkomprimierte DICOM-Dateien handelt, kann die Software sie nicht lesen und importieren, also entfernen Sie alle anderen Dateien aus diesem Ordner. - Scrolle zu einem beliebigen Bild des Phantoms, in dem sich ein klarer Kreis mit jeweils drei dunklen Löchern befindet. Klicken Sie auf die Mitte des Phantoms, und es erscheint ein roter Kreis. Klicken Sie auf den Kreis, und ziehen Sie ihn, bis er den gleichen Durchmesser hat und mit dem Umfang des Phantoms übereinstimmt (siehe Abbildung 2).
- Die Koordinaten dieser Position werden als "Ausgangsposition" bezeichnet. Speichern Sie diese, indem Sie auf Set L/R, A/P und S/I klicken.
- Klicken Sie auf Jog-Modus aus, entfernen Sie die Registrierungsspitze vom Schallkopfarm und wählen Sie dann Fokussuche beenden. Bestätigen Sie die Ausgangsposition, um die Initialisierungssequenz abzuschließen.
6. Vorbereitung von Tieren auf SDT
- Betäubung der Maus mit einem Isofluran-O2-Gasgemisch in einer Induktionskammer. Stellen Sie die Gasdurchflussrate auf 1,0 ml/min und den Verdampfer auf 2,0 % für die Anästhesieeinleitung ein, was in der Regel 3-5 Minuten in der Kammer erfordert (siehe Materialtabelle).
- Beurteilen Sie das Tier auf eine ausreichende Sedierung, indem Sie in den Zeh kneifen. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf, um Trockenheit der Hornhaut zu vermeiden.
HINWEIS: Überwachen Sie die Anästhesietiefe während des gesamten Eingriffs. - Injizieren Sie der Maus 40 μl Gadolinium-Kontrastmittel durch die Schwanzvene (siehe Materialtabelle).
- Entfernen Sie alle Haare, die die Kopfhaut oberhalb des Schädels behindern, mit einer Haarentfernungscreme und einem elektronischen Rasierer.
- Befestigen Sie das Tier mit den folgenden Schritten am MRT-Bett (siehe Abbildung 3).
- Schließen Sie das Einlassrohr des MRT-Bettes (Abbildung 3A) für die Anästhesie an eine Isofluranquelle an und stellen Sie die Gasflussrate auf 1,0 ml/min und den Verdampfer auf 2,0 % für die Anästhesieeinleitung ein. Schließen Sie das Auslassrohr an einen Aktivkohlefilterbehälter an, um die Anästhesie zu absorbieren.
- Setzen Sie das Nasenkonusstück in seinen Schlitz ein, wie in Abbildung 3B gezeigt. Schieben Sie die Beißstange durch die Beißstangenlöcher sowohl im Nasenkonus als auch am Ende des Bettes, wie gezeigt, wobei das Ende des Beißschutzes über der offenen Vertiefung im MRT-Bett schwebt.
- Legen Sie das Tier auf das MRT-Bett, wobei die Ohren mit den stereotaktischen Ohrbügellöchern ausgerichtet sind, und stecken Sie seine Zähne durch den Beißschutz, um ihn an Ort und Stelle zu halten. Schieben Sie den Nasenkonus nach vorne, so dass er sich über der Schnauze des Tieres befindet, um einen gleichmäßigen Anästhesiestrahl zu gewährleisten.
- Schieben Sie die Ohrbügel durch die Löcher auf beiden Seiten des MRT-Bettes und heben Sie den Kopf des Tieres an, bis beide Ohrstangen in die Gehörgänge der Maus passen.
HINWEIS: Drücken Sie nicht zu weit, da dies das Trommelfell des Tieres beschädigen kann. - Stellen Sie sicher, dass sich das Tier in einer bequemen Position befindet. Schrauben Sie dann mit einem Schlitzschraubendreher die MRT-kompatiblen Schrauben ein, um beide Ohrstangen, den Nasenkonus und die Beißstange zu verriegeln. Dadurch wird das Tier fixiert und jede Kopfbewegung verhindert, bis das Tier aus dem Bett genommen wird.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Positionierung des Tieres auf dem MRT-Bett nach diesem Schritt nicht gestört wird. Wenn sich das Tier bewegt, muss die gesamte Einrichtung (Schritt 6.5) wiederholt werden, unabhängig davon, wie weit das Protokoll fortgeschritten ist. - Während das Tier wartet, legen Sie das MRT-Bett auf ein warmes Wärmekissen, um die Körpertemperatur zu halten.
HINWEIS: Überwachen und halten Sie die Körpertemperatur während des gesamten Eingriffs.
- Isofluran wird dem Tier während der gesamten Behandlung kontinuierlich über Schläuche zugeführt, die an den Nasenkegeln befestigt sind, wenn das Tierbett mit den auf der Plattform vorgesehenen Halterungen auf dem FUS-System befestigt ist.
7. MRT-Verfahren
- Nehmen Sie das MRT-Bett mit dem stereotaktisch fixierten Tier und legen Sie es in die MRT-Halterung, die zuvor mit dem MRT-Scanner verbunden war (siehe Materialtabelle), indem Sie das MRT-Bettloch an seinem Ende an den Stift der MRT-Halterung stecken, wie in Abbildung 3 gezeigt. Befestigen Sie die Ein- und Auslass-Anästhesieschläuche an den entsprechenden Schläuchen im MRT-Gerät.
- Schieben Sie die MRT-Halterung mit dem Tier in die MRT-Bohrung und achten Sie darauf, dass Sie die gleiche Position beibehalten, in der das Phantom platziert wurde.
- Führen Sie einen Lokalisierer durch, um die Position des Tiergehirns zu sehen, und führen Sie dann einen T1-gewichteten MRT-Scan nach dem Kontrast durch, der das gesamte Gehirn mit den MRT-Einstellungen aus Tabelle 2 abdeckt.
- Exportieren Sie den MRT-Scan als einen Satz unkomprimierter DICOM-Dateien, eine für jede Schicht.
8. Fokussierte Ultraschallbehandlung (Abbildung 4)
- Nehmen Sie das Tier nach Abschluss des Scans aus der MRT-Halterung und legen Sie es auf die Plattform, indem Sie die Vorderseite des Bettes in den entsprechenden Stift an der Rückseite der Plattform stecken und die Rückseite des Bettes in den entsprechenden Stift stecken.
- Schließen Sie das Einlassrohr des MRT-Bettes für die Anästhesie an eine Isofluranquelle an und stellen Sie die Gasflussrate auf 1,0 ml/min und den Verdampfer auf 2,0 % ein, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten. Schließen Sie das Auslassrohr an einen Aktivkohlefilterbehälter an, um die Anästhesie zu absorbieren.
- Übertragen Sie die DICOM-Dateien auf den Computer und legen Sie sie in einem Ordner im Hauptarbeitsverzeichnis der aktuellen Studie ab.
HINWEIS: Informationen zu den Dateianforderungen finden Sie in Schritt 5.9. - Gehen Sie in der Software auf die Hauptinitialisierungsseite und aktivieren Sie den Jog-Modus , indem Sie auf Guided Focus Finding und dann auf Jog Mode On klicken.
- Geben Sie einen Klecks zentrifugiertes Ultraschallgel auf den Kopf des Tieres, mit genügend Gel, um die gesamte Kopfhaut über dem Schädel zu bedecken.
- Gießen Sie DI und entgastes Wasser bis zu 80 % in das Wasserbad und setzen Sie das Wasserbad dann auf die entsprechenden Säulen auf der Plattform.
- Senken Sie das mit DI-Wasser gefüllte Wasserbad ab, bis die untere Membran das Ultraschallgel auf dem Kopf des Tieres berührt und eine Kopplungsfläche zwischen Wasser und Gel bildet. Achten Sie darauf, dass das Ultraschallgel den gesamten Kopf des Tieres bis zum Wasserbad bedeckt und dass sich keine Luftblasen im Ultraschallgel zwischen dem Wasserbad und der Kopfhaut der Maus befinden.
- Tauchen Sie den Ultraschallwandler in das Wasserbad ein und stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen auf der Oberfläche des Schallkopfes bilden.
- Senken Sie den Wandlerarm mit dem Jog-Modus nach unten in Richtung des teilweise untergetauchten Wandlers und koppeln Sie ihn mit dem Wandler, indem Sie die magnetischen Schlitze zueinander ausrichten, während die Wandleroberfläche untergetaucht bleibt.
- Deaktivieren Sie den Jog-Modus und dann die Option "Fokussierte Suche beenden", wie Sie es während des Initialisierungsschritts getan haben. Stellen Sie sicher, dass Sie die Ausgangsposition wie zuvor bestätigen.
- Wechseln Sie zur Registerkarte "Behandlung" und laden Sie dann die T1-gewichteten MRT-Dateien nach dem Kontrast hoch, indem Sie auf das Ordnersymbol oben in der Mitte des Bildschirms klicken. Wählen Sie den Ordner mit den DICOM-Dateien aus, die zuvor auf den Computer hochgeladen wurden, und öffnen Sie sie. In diesem Schritt sollten automatisch alle DICOM-Dateien im oberen rechten Bereich geladen werden.
- Wählen Sie als Nächstes auf der Registerkarte Beschallungsmodus den richtigen Behandlungsmodus aus, indem Sie entweder Burst oder Continuous Wave auswählen. Wenn Sie sich im Burst-Modus befinden, geben Sie auf der Registerkarte Beschallungseinstellungen die Burst-Länge, die Burst-Periode und die Anzahl der Perioden ein. Diese Parameter entsprechen jedem Beschallungsort. Wenn Sie sich im Dauerstrichmodus befinden, geben Sie nur die Beschallungsdauer ein.
HINWEIS: In dieser Studie wurde der Dauerstrichmodus für eine Dauer von 120 s verwendet. - Klicken Sie auf das Zielsymbol oben in der Mitte der Seite und wählen Sie die richtigen Stellen auf der richtigen MRT-Schicht aus, an denen die FUS-Fokusregion anvisiert werden soll. An der angeklickten Stelle wird ein hellrotes Quadrat mit einem roten Kreis angezeigt. Es kann mehr als eine Auswahl ausgewählt werden.
- Links neben dem MRT-Bild befindet sich eine Tabelle, die mit den 3D-Koordinaten der ausgewählten Fokusregionen gefüllt wird. Geben Sie in der letzten Spalte der Tabelle die zu beschallende Leistung an jedem Brennfleck ein, die für jeden verwendeten Schallkopf separat berechnet werden kann, um die gewünschten Druck- oder Intensitätsstufen zu erhalten. Klicken Sie zur Bestätigung auf jeden Fokuspunkt in der Tabelle, was dazu führt, dass die Koordinaten hervorgehoben werden und der entsprechende Fokusbereich auf dem Bild blau wird.
HINWEIS: Lesen Sie das Datenblatt des Messumformers, um zu bestimmen, wie der in der Tabelle eingegebene Leistungspegel in Druck oder Intensität umgerechnet wird, da diese Werte aufnehmerspezifisch sind. - Wenn Sie mit allen Fokusbereichen zufrieden sind, wählen Sie Bewegungstest. Dadurch wird die Software aufgefordert, den Schallkopf zu allen Brennpunkten zu bewegen, um sicherzustellen, dass die Bewegungen möglich sind. Nach der Bestätigung zeigt die Software " Bewegungstest abgeschlossen" an. Wenn ein Fehler auftritt, stellen Sie die Fokusbereiche so ein, dass sie in die 3D-Achsen der Wandlermotoren passen.
- Wenn Sie fertig sind, wählen Sie Beschallung beginnen, um das Beschallungsprotokoll zu starten, indem Sie den Schallkopf bewegen und die richtigen FUS-Parameter auf jede ausgewählte Fokusregion anwenden.
- Sobald das Beschallungsprotokoll abgeschlossen ist, entkoppeln Sie den Schallkopf vom Schallkopfarm, entfernen Sie das Wasserbad von der Plattform und wischen Sie das Ultraschallgel von der Kopfhaut des Tieres ab.
- Schrauben Sie die Gebiss- und Ohrstangen ab, nehmen Sie das Tier aus dem MRT-Bett und legen Sie es dann auf eine warme Unterlage, bis das Tier aus der Narkose erwacht. An dieser Stelle bringst du das Tier wieder in seinen Käfig zurück.
- Bei den nachfolgenden Tieren ist das gleiche Protokoll ab Abschnitt 6 zu wiederholen.
- Sobald die gewünschten Tiere behandelt sind, reinigen Sie alle Oberflächen, die von Tieren berührt werden, mit 70%igem Ethanol (siehe Materialtabelle).
- Beenden Sie die Software, und fahren Sie dann jedes Gerät herunter und schalten Sie es aus.
9. Schritte nach der Behandlung
- Wiederholen Sie das In-vivo-Bildgebungssystem (IVIS)-Protokoll aus Abschnitt 1 für Biolumineszenzmessung 24 Stunden nach der Behandlung. Um die Wirksamkeit der Behandlung zu analysieren, vergleichen Sie die Biolumineszenzaufzeichnungen vor und nach der Behandlung, um die Wachstumsrate sowohl für behandelte als auch für unbehandelte Gruppen zu bestimmen.
- Führen Sie MRT-Folgeuntersuchungen mit den gleichen Einstellungen wie in Schritt 6.4 durch. Vergleichen Sie mit kontrastmittelverstärkten Scans die mittlere Graustufenintensität der Tumorregion oder berechnen Sie das Gesamtvolumen, das mit dem Kontrastmittel abgedeckt wird, um Unterschiede im Tumorvolumen vor und nach der Behandlung zu ermitteln.
Representative Results
Die Tumorgröße nimmt bei Tieren, die 24 Stunden nach der Behandlung mit SDT behandelt wurden, ab.
Am Tag der SDT-Behandlung betrug das ursprüngliche durchschnittliche Biolumineszenzsignal für die Kontroll- und Behandlungsgruppe (N = jeweils 4) 2,0 x 10 6 ± 3,1 x 10 6 bzw. 2,3 x 10 6 ± 1,3 x 10 6 p/s/cm2/sr. Die durchschnittlichen Biolumineszenzwerte, die der Tumorgröße vor der Behandlung entsprachen, waren zwischen den beiden Gruppen statistisch nicht signifikant (p = 0,89). Das durchschnittliche Biolumineszenzsignal der Behandlungsgruppe betrug 3,57 x 10 6 ± 2,3 x 10 6 24 h nach SDT, während das biolumineszierende Signal der Kontrollgruppe auf 5,5 x 10 6 ± 8,2 x 10 6 p/s/cm2/sr erhöht war. Wie in Abbildung 5 dargestellt, entspricht dies einer Wachstumsrate von 83,4 % ± 78 % bzw. 172 % ± 34 %, wenn man von einem exponentiellen Wachstum ausgeht (p = 0,08). Von den vier behandelten Tieren wiesen drei im Vergleich zu den Kontrollen niedrigere Wachstumsraten nach der Behandlung auf. Es gab einen Ausreißer in der Behandlungsgruppe, der ein vergleichbares Wachstum wie die Kontrollen zeigte, wodurch die Abweichungen verzerrt wurden.
Zusätzlich wurden die Tiere am Tag nach der Behandlung einer kontrastmittelverstärkten MRT-Bildgebung unterzogen, um den Tumor vor und nach der Behandlung zu vergleichen. Die durchschnittliche Graustufenintensität des Kontrastmittels in Tumoren wurde über jeden MRT-Schnitt für jedes Tier durchgeführt, um zu messen, wie viel Kontrastmittel nach der Behandlung in den Tumor gelangte, als Schätzung der Tumorgröße. Vor der Behandlung war die durchschnittliche Graustufenintensität des Tumors zwischen der Kontroll- und der behandelten Gruppe ähnlich. Im Mittel stieg diese Graustufenintensität in der Kontrollgruppe stärker an als in den behandelten Gruppen, obwohl dies nicht signifikant war (p = 0,47). Diese Daten sind in Tabelle 2 zu sehen. Die hohe Variabilität dieser Ergebnisse ist möglicherweise auf die Tatsache zurückzuführen, dass MRTs erst 24 Stunden nach der Behandlung aufgenommen wurden, zu diesem Zeitpunkt beginnt das therapeutische Potenzial der SDT erst zu beginnen. Abbildung 6 zeigt jedoch ein Beispiel für die durch SDT verursachten Läsionen.
Abbildung 1: Einrichtung des FUS-Systems. (Nach oben) MRgFUS-System mit beschrifteten Komponenten. (Vorderseite) 1. Plattform. 2. Achse motorisierter Wandlerarm. 3. FUS-Wandler. 4. Wasserbad. 5. MRT-Bett. 6. Überwachen. 7. Wandler-Impedanzanpassungsbox. 8. Leistungsverstärker-Box. 9. Funktionsgenerator. 10. Funktionsgenerator Kanal 1 BNC-Anschluss. 11. Desktop-Computer. (Unten) MRgFUS-System mit farbcodiertem Schaltplan mit folgenden Anschlüssen. (Zurück) 1. Netzkabel. 2. Überwachen Sie HDMI auf Desktop-HDMI. 3. Anschluss B USB B an Desktop USB A. 4. Oszilloskop LAN-Ethernet zu Desktop-Ethernet. 5. Motion-Interface-Ethernet zu Desktop-Ethernet. 6. Oszilloskop Aux-Eingang/-Ausgang BNC zu AWG-Eingang BNC. 7. Oszilloskop Kanal 1 (vorne) BNC zu SYNC BNC. 8. Anpassung des Box-Ausgangs-BNC an den HF-Eingang koaxial. 9. HF-Ausgang koaxial zu passender Box koaxial. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Phantom-Registrierung. (A) System-Setup und Software während der Phantom-Registrierung. (B) Screenshot des Phantomregistrierungsbildschirms, wobei der rote Kreis der ausgewählte Umfang des axialen Querschnitts ist. (C) Phantom auf dem MRT-Bett, Draufsicht. (D) Seitenansicht des Phantoms, wobei sich die rote Linie in der axialen Scheibe befindet, die dem Kreis in C entspricht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Platzierung der Tiere . (A) MRT-Bett und -Wiege, mit verschiedenen Teilen beschriftet: 1. MRT-Wiege. 2. Stereotaktisches MRT-Bett. 3. Ohrbügel. 4. Beißbalken. 5. Nasenkegel. 6. MRT-Bettklammerloch. 7. Isofluran-Anästhesieröhrchen. (B) Illustration, die die Platzierung der Maus auf dem MRT-Bett und die Platzierung auf der Halterung mit der HF-Spule (Orange) darstellt (Abbildung modifiziert mit der Vorlage Biorender 2022). (C) Illustration, die die Platzierung der Maus auf dem MRT-Bett während einer FUS-Behandlung darstellt (Abbildung modifiziert mit der Vorlage Biorender 2022). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Auswahl des Fokuspunkts. Beispiel für die Auswahl eines Beschallungspunktes bei einem einzelnen Tier. Jede Säule stellt eine T1-gewichtete postkontrastierende MRT-Schicht dar, wobei jede Schicht 0,5 mm in proximaler (Schicht 1) bis distale (Schicht 5) Richtung liegt. Die Tumorgrenze wurde manuell segmentiert und ist rot umrandet (Zeile 1), und die entsprechenden Beschallungsorte (Zeile 2) werden durch ein hellgrünes Quadrat (fokales maximales Zentrum) und einen blauen Kreis (halber maximaler fokaler Umfang) dargestellt. Jede Stelle wurde 2 Minuten lang beschallt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Wachstumsrate nach SDT. Die Wachstumsrate von GBM-Tumoren von vor bis 24 h nach der SDT-Behandlung bei behandelten und unbehandelten (Kontroll-)Tieren mit intrakraniellen M59-Tumoren basierend auf der gemessenen Lumineszenz. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an. Zur Bestimmung der Signifikanz wurde ein T-Test mit zwei Stichproben durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: SDT-generierte Läsion. Prä- und Post-Kontrastmittel verbessern T1-gewichtete MRT-Scans aus einem Tiermodell mit einem repräsentativen axialen Schnitt, der eine durch SDT erzeugte Läsion im Tumor zeigt. (Links) MRT-Scan, der vor der SDT-Behandlung durchgeführt wurde, wobei der Tumor rot umrandet ist. (Mitte) FUS-Fokuspunktauswahl, bei der der maximale Druck durch hellblaue Kreise und die halbwertigen Druckbereiche durch blaue Kreise dargestellt werden. (Rechts) MRT-Scans nach SDT, bei denen der Tumor rot umrandet ist. SDT-erzeugte Läsionen und das Spritzenloch für die Implantation werden gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Reihenfolge | T1 |
| Wiederholungszeit | 3000 ms |
| Echo-Zeit | 30 ms |
| Dicke der Scheibe | 0,5 Millimeter |
| Anzahl der Scheiben | 25 |
| Pixelabstand | 0,187 mm x 0,187 mm |
| Akquisitions-Matrix | 133 x 133 cm anzeigen |
| Durchschnitte | 4 |
Tabelle 1: MRT-Einstellungen.
| Steuerung | SDT-Gruppe | p-Wert | |
| Vorbehandlung | 7,49 x 10 3 ± 2,2 x 103 | 7,48 x 10 3 ± 1 x 103 | 0.99 |
| Nachbehandlung | 8,79 x 103 ± 7,7 x 102 | 7,95 x 10 3 ± 1,1 x 103 | 0.33 |
| Prozentuale Differenz | 16 % ± 16 % | 7% ± 12% | 0.47 |
Tabelle 2: T1-gewichtete MRT-Graustufen nach dem Kontrastmittel.
Discussion
Für Patienten mit GBM sind neue therapeutische und wirksame Behandlungsmöglichkeiten notwendig. In diesem Protokoll wurde eine präklinische FUS-vermittelte Behandlung von GBM beschrieben, die derzeit einer umfangreichen Untersuchung für die klinische Translation unterzogen wird. Obwohl die SDT ein spannendes Potenzial hat, gibt es im präklinischen Umfeld noch viel zu verstehen und zu optimieren.
Eine der wichtigsten Komponenten dieses Protokolls ist die Verwendung von MR-gesteuerter FUS, um den Tumor für maximale Wirksamkeit anzuvisieren. Mit Hilfe eines Phantoms kann ein 3D-Koordinatenraum erstellt werden, in dem jedem Pixel axialer MRT-Schichten eine Koordinate zugeordnet werden kann. Ein einfaches Verfahren zur Auswahl des Beschallungsortes auf dem MRT-Bild informiert den Schallkopf darüber, wohin er zielen soll. Das verwendete präklinische FUS-System ist sehr vielseitig und anwendbar, wenn es darum geht, Stellen bestimmter Pathologien wie einen Tumor anzuvisieren, einschließlich tiefer sitzender Tumore, die ohne bildgebende Bestätigung nur schwer zu erreichen wären. Durch die Verwendung von Gadolinium als Kontrastmittel wird der Tumor klar visualisiert, so dass der Benutzer bei der Auswahl der Ziele fundierte Entscheidungen treffen kann. Der Vorteil der SDT gegenüber vielen anderen Behandlungen ist, dass es sich um eine tumorspezifische Therapie handelt. FUS niedriger Intensität sollte nur auf das Tumorgewebe abzielen, während das gesunde Hirnparenchym relativ unberührt bleibensollte 3,8.
Die Ergebnisse dieses Experiments zeigen, wie die Vorteile dieses Protokolls zu therapeutischen Ergebnissen führen können, die anderen Befunden in der Literatur für SDT ähneln. Abbildung 5 zeigt, dass es innerhalb von nur 24 Stunden nach dem Tag der Behandlung zu einer Verlangsamung des Tumorwachstums in der behandelten Kohorte kam. Obwohl sie bei dieser kleinen Stichprobengröße nicht signifikant ist, kann sich die Signifikanz bei einer größeren Anzahl von Tieren ergeben. Diese Verzögerung des Tumorwachstums ähnelt dem, was in der bahnbrechenden Arbeit von Wu et al. (2019) zu diesem Thema gezeigt wurde, die bei behandelten Tieren ein verlangsamtes Tumorwachstum im Laufe der Zeit sowie eine erhöhte Überlebenszeit aufwies9.
Zu den Überlegungen, die bei der Entwicklung dieses Protokolls angestellt wurden, gehörten der Tierstamm, der Tumortyp und die Auswahl der Sonosensibilisierungsmittel. Athyme Nacktmäuse wurden aus mehreren Gründen für dieses Protokoll ausgewählt. Erstens ist die nackte Maus leichter zu beschallen, da das Fehlen von Haaren eine Dämpfung verhindert. Das Fehlen eines Immunsystems ermöglicht auch die Implantation von patientenabgeleiteten Xenotransplantaten (PDXs), so dass das Tumormodell der klinischen Situation näher kommt. Der Nachteil der Verwendung eines athymischen Modells besteht darin, dass das Immunsystem nicht charakterisiert werden kann, so dass in diesen Studien keine SDT-generierte Immunantwort gemessen wird10. Bei der gewählten Tumorlinie handelt es sich um eine aggressive und schnell wachsende PDX-Linie. Der Zeitpunkt der Behandlung ist sehr wichtig, da die Etablierung des Tumors überprüft werden muss, die Tumorlast jedoch nicht die Schädelhälfte ausfüllen sollte. Unterschiedliche Zelllinien benötigen unterschiedliche Inkubationszeiten, um einen Tumor mit optimaler Größe für präklinische Experimente zu erhalten. In diesem Protokoll wurde 5-ALA als Sonosensibilisator verwendet, da es bevorzugt in GBM-Tumoren aufgenommen wird, was in vitro für diese Zelllinie in früheren Experimenten bestätigt wurde (unveröffentlichte Daten). Andere Sonosensibilisatoren können substituiert und getestet werden, um die für Wirksamkeit und Sicherheit am besten geeignete Verbindung zu bestimmen. Schließlich wurde die Behandlung 3 Stunden nach der 5-ALA-Injektion begonnen, da die bisherige Literatur gezeigt hat, dass dies der optimale Zeitpunkt für diese Injektionsdosis5 ist.
Die in diesem Protokoll gewählten FUS-Parameter (10 W/cm2 für 2 min bei 515 kHz an jedem Zielort) wurden auf der Grundlage einer Literaturrecherche und erster Experimentefestgelegt 4,9. Es wurde ein Raster von Beschallungspunkten gewählt, das den gesamten Tumor abdeckt, um den ROS-Effekt im gesamten Tumor zu erzeugen. Die hier verwendete Intensität ist höher als bei anderen Publikationen, aber in einer kurzen Zeitspanne ist nicht zu erwarten, dass dies zu nachteiligen temperaturbedingten Effekten führt, da Intensitäten von bis zu 25 W/cm2 in einem Mausmodell ohne signifikante Nebenwirkungen erfolgreich eingesetzt wurden11. Wichtig ist, dass in der Literatur kein standardisierter oder optimierter Satz von FUS-Parametern veröffentlicht wurde. Daher können die spezifischen Werte, die hier angegeben werden, angepasst werden, um den optimalen Satz von Parametern zu bestimmen, was zu einer maximalen Reduzierung des Tumorgewebes bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung der Sicherheit führt. Da verschiedene Zelllinien unterschiedliche Grade der Vaskularisierung und Hypoxie aufweisen, muss diese Behandlung möglicherweise angepasst werden. Wir haben ein insgesamt verringertes Tumorwachstum (Abbildung 5) innerhalb von 24 Stunden nach der SDT-Behandlung gezeigt, obwohl die Parameter optimiert werden müssen und mehr Tiere getestet werden müssen, um die maximale Wirkung dieser Behandlung zu bestimmen. MRT-Scans nach der Behandlung zeigen kein Auftreten von Läsionen, die durch die FUS-Behandlung in gesundem Gewebe entstanden sind, wobei der Effekt auf das Tumorgewebe begrenzt ist (Abbildung 6). Es besteht auch die Möglichkeit, SDT mit anderen FUS-Techniken zu kombinieren, wie z. B. der vorübergehenden Permeabilisierung der Blut-Hirn-Schranke, um die 5-ALA-Aufnahme im Tumor zu maximieren12. Dieses Protokoll kann durch die Durchführung verschiedener histologischer Techniken ergänzt werden, um die Sicherheit und Wirksamkeit auf struktureller Ebene zu überprüfen. Eine Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) kann durchgeführt werden, um nach strukturellen Schäden oder Tumorschädenzu suchen 13, während eine terminale Desoxynukleotidyltransferase-dUTP-Nick-End-Markierungsfärbung (TUNEL) durchgeführt werden kann, um nach zellulärer Apoptose zu suchen14. Unabhängig davon stellt dieses Protokoll eine sichere und tumorspezifische Behandlung dar, bei der die Veränderungen auch 24 Stunden nach der Behandlung spürbar sind, was durch den Vergleich der Wachstumsrate von Tumoren, die mit SDT behandelt wurden, und unbehandelten Tumoren sowie durch den Vergleich von Tumorschnitten vor und nach der Beschallung deutlich wird.
Bei jedem Protokoll gibt es immer Nachteile oder Einschränkungen, die abgewogen werden müssen. Die Haupteinschränkung des aktuellen Protokolls ist der Zeit- und Kostenaufwand. Einer der Vorteile dieses Protokolls ist sein automatisiertes, fokussiertes Ziel. Um dieses fokussierte Verfahren durchzuführen, müssen MRT-Scans für jedes einzelne Tier durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass der Tumor korrekt anvisiert wird, ein Prozess, der sowohl zeitaufwändig als auch teuer sein kann. Darüber hinaus kann die Zeitspanne für die Durchführung dieses Protokolls je nach gewünschter Anzahl von Brennpunkten selbst bei wenigen Tieren Stunden betragen, was zu einer geringen Anzahl von Versuchstieren führt. Trotz dieser Nachteile bleibt dieses gezielte nicht-invasive Protokoll im Vergleich zu offenen Operationsoptionen eine praktikable Präferenz.
Zusammenfassend zeigte dieses Protokoll die Fähigkeit der SDT-Behandlung, das Tumorwachstum im Gehirn innerhalb von 24 Stunden nach der Behandlung zu verringern und gleichzeitig gesundes Nervengewebe in einem präklinischen Mausmodell zu erhalten. Studien zur Wirksamkeit von SDT und zur Optimierung der verschiedenen Parameter zur Steigerung der ROS-Produktion sind notwendig, um diese Behandlung klinisch geeignet zu machen. Es sollten neue Wege für den Einsatz von SDT als nicht-invasives Therapiemodell beschritten werden.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass die Forschung in Abwesenheit von kommerziellen oder finanziellen Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten. Amir Manbachi unterrichtet und berät für BK Medical (GE Healthcare) und Neurosonics Medical und ist Erfinder einer Reihe von zum Patent angemeldeten FUS-Technologien. Betty Tyler erhält Forschungsgelder von den NIH und ist Miteigentümerin von Accelerating Combination Therapies*. Ashvattha Therapeutics Inc. hat auch eines ihrer Patente lizenziert und ist Aktionärin von Peabody Pharmaceuticals (*einschließlich Aktien oder Optionen).
Acknowledgments
Die Autoren danken für die finanzielle Unterstützung durch den STTR Phase 1 Award der National Science Foundation (NSF) (#: 1938939), den ASME Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) Award (#: N660012024075) und das Clinical Research Scholars Program (KL2) des Johns Hopkins Institute for Clinical and Translational Research (ICTR), das vom National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS) der National Institutes of Health (NIH) verwaltet wird. Die Zellen wurden von der Mayo Foundation for Medical Education and Research gekauft und zur Verfügung gestellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| 1 mL Syringes | BD | 309597 | |
| 10 µL Hamilton syringe | Hamilton Company | 49AL65 | |
| 10 µL Pipette tips | USAScientific | ||
| 1000 mL Flask | Corning | MP-34514-25 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | CLS430791 | |
| 200 Proof ethanol | PharmCo | 111000200 | |
| 5 mL pipettes | Falcon | 357543 | |
| 50 mL Conical tubes | Corning | 430290 | |
| 500 mL filter | Corning | 431097 | |
| 5-Aminolevulinic acid hydrochloride | Research Products International | A11250 | |
| 7T PET-MR system | Bruker | Biospec 70/30 | |
| Aluminum foil | Reynolds Brand | ||
| Amplifier | FUS Instruments | 2175 | |
| Athymic nude mice | Charles River Laboratories | Strain Code 490 | |
| Bone drill | Foredom | HP4-917 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004261 | |
| Charcoal isoflourane waste container | Patterson scientific | 78909457 | |
| Computer | FUS Instruments | 2269 | |
| Cover glass | Fisherbrand | 12-545J | |
| Desktop monitor | ASUS | VZ239H | |
| D-Luciferin | Gold Biotechnology | LUCK-1G | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Electronic shaver | Wahl | 93235-002 | |
| Eppendorf tubes | Posi-Click | 1149K01 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Formalin | Thermo Fisher Scientific | SF100-20 | |
| Function generator | Siglent | QS0201X-E01B | |
| Gadolinium contrast agent (Gadavist) | McKesson Corporation | 2068062 | |
| Gauze | Henry Schein | 101-4336 | |
| Heat lamp | |||
| Heat pad | Kent Scientific | RT-0501 | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-12 | |
| Induction chamber | Patterson scientific | 78933388 | |
| Isofluorane vaporizer | Patterson scientific | 78916954 | |
| Isoflurane | Covetrus | 29405 | |
| Isoflurane system | Patterson Scientific | 78935903 | |
| IVIS spectrum | Perkin Elmer | 124262 | |
| Lightfield microscope | BioTek | Cytation 5 | |
| Nair | Church and Dwight Co. | 42010553 | |
| Ophthalmic ointment | Puralube vet ointment | ||
| P-20 pippette | Rainin | 17008650 | |
| Patient derived xenographs | Mayo Clinic | M59 | |
| Penicillin/Streptomyosin | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | 70-011-069 | |
| Pippetter | Drummond | 4-000-101 | |
| Povidone-iodine | Covetrus | PI050CV | |
| RK-50 MRgFUS system | FUS Instruments | 2182 | |
| Scale | |||
| Scalpel blade | Covetrus | 7319 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Screwdriver set | Jakemy | JM-8160 | |
| Skin marker | Time Out | D538,851 | |
| Staple remover | MikRon | ACR9MM | |
| Stapler | MikRon | ACA9MM | |
| Staples | Clay Adams | 427631 | |
| Stereotactic frame | Kopf Instruments | 5000 | |
| Stereotactic MRI prototype plastic imaging fixture | FUS Instruments | ||
| T-25 culture flask | Corning | 430641U | |
| Transducer and matching box | FUS Instruments | T515H750-118 | |
| Ultrasonic degasser | FUS Instruments | 2259 | |
| Ultrasound gel | ParkerLabs | 01-08 | |
| Water bath | FUS Instruments | ||
| Xylazine | Covetrus | 1XYL006 |
References
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