Neuromodulação por Ultrassom Focalizado de Culturas Neurais Humanas In Vitro em Matrizes de Microeletrodos Multi-Poço

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para o uso de um sistema de alto rendimento que permite o monitoramento e a quantificação dos efeitos neuromodulatórios do ultrassom focalizado em neurônios de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (HiPSC).

Abstract

Os efeitos neuromodulatórios do ultrassom focalizado (FUS) têm sido demonstrados em modelos animais, e o USF tem sido usado com sucesso para tratar distúrbios psiquiátricos e de movimento em humanos. No entanto, apesar do sucesso da USF, o mecanismo subjacente aos seus efeitos sobre os neurônios permanece pouco compreendido, dificultando a otimização do tratamento pelo ajuste dos parâmetros do USF. Para suprir essa lacuna no conhecimento, estudamos neurônios humanos in vitro usando neurônios cultivados a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (HiPSCs). O uso de HiPSCs permite o estudo de comportamentos neuronais específicos de humanos em estados fisiológicos e patológicos. Este relato apresenta um protocolo para o uso de um sistema de alto rendimento que permite monitorar e quantificar os efeitos neuromodulatórios do USF sobre os neurônios HiPSC. Variando os parâmetros do FUS e manipulando os neurônios HiPSC através de modificações farmacêuticas e genéticas, os pesquisadores podem avaliar as respostas neurais e elucidar os efeitos neuromodulatórios do FUS nos neurônios HiPSC. Esta pesquisa pode ter implicações significativas para o desenvolvimento de terapias seguras e eficazes baseadas em FUS para uma variedade de distúrbios neurológicos e psiquiátricos.

Introduction

O ultrassom focalizado (FUS) é uma modalidade promissora de neuromodulação que permite a estimulação não invasiva em centímetros de profundidade com resolução submilimétrica ^1,2,3. Apesar desses pontos fortes, o impacto clínico do USF é limitado, em parte devido à falta de conhecimento sobre seu mecanismo de ação. Sem uma base teórica sólida, pesquisadores e clínicos enfrentam dificuldades em adaptar a terapia para atender às necessidades específicas de pacientes individuais sob condições variadas. Uma teoria proeminente proposta por Yoo et ^al.4 sugere que os canais iônicos mecanossensíveis são responsáveis pela ativação dos neurônios. No entanto, essa teoria falha em explicar a ativação do USF em neurônios cerebrais humanos, que carecem desses canais⁵. Essa ambiguidade limita o uso do USF na clínica, pois impede o ajuste dos parâmetros do USF para otimizar os resultados do tratamento.

Estudos anteriores relacionados empregaram uma variedade de abordagens para investigar os mecanismos fisiológicos subjacentes ao USF e determinar os parâmetros ótimos de estimulação. Uma etapa crucial nesse processo envolve o monitoramento das respostas neuronais como feedback, que pode ser obtido por meio de métodos que envolvem monitoramento por portas iônicas, como imagens por íons cálcio⁴, imagens ópticas¹ e registro eletrofisiológico ex vivo (por exemplo, eletromiografia⁶ ou eletrofisiologia pele-nervo⁷). No entanto, a maioria desses estudos usa neurônios não humanos ou abordagens in vivo, o que pode introduzir variações adicionais devido a controles subótimos. Em contraste, o uso de eletrodos para medir sinais neuronais em neurônios de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (HiPSC) in vitro oferece medidas mais sensíveis e maior controle sobre o ambiente experimental. Neste trabalho, um sistema in vitro foi desenvolvido utilizando arranjos de microeletrodos (MEAs) para medir as respostas elétricas de neurônios HiPSC após estimulação com USF, como mostra a Figura 1. Esse sistema capacita os pesquisadores da comunidade a monitorar as respostas neuronais ao variar os parâmetros do ultrassom (por exemplo, frequência, comprimento de explosão, intensidade). Além disso, esse sistema permite um alto nível de controle da sensibilidade neuronal a estímulos físicos (por exemplo, temperatura, pressão e cavitação)^8,9, uma vez que a funcionalidade dos canais iônicos dos neurônios pode ser manipulada genética e farmacologicamente (por exemplo, usando gadolínio para inibir canais iônicos)10,11,12. Esse controle em nível molecular pode ajudar a elucidar os mecanismos por trás dos efeitos neuromodulatórios da FUS.

Protocol

1. Preparação dos materiais Aspirar o meio de cultura e utilizá-lo para preencher um único poço em uma placa de cultura de neurônios de 24 poços com MEA embutido (Figura 2A). Cultivar e induzir os neurônios seguindo o protocolo publicado por Taga et al.13. Esterilizar a interface parafilme, o elástico e o cone de FUS com sua membrana de borracha usando etanol 70% por 10 min e colocá-los no exaustor para posterior montagem. Degas 300 mL de água deionizada e 50 mL de gel de acoplamento. Centrifugar a água e o gel a 160 x g durante 5 min para evitar a indução de cavitação no meio de acoplamento.Observação : A origem original dos HiPSCs é de linhas de célula GM01582 e CIPS. Em média, pode-se obter uma densidade de 5 x 104 neurônios motores e 2,5 x 104 astrócitos por poço14. 2. Conexão e configuração dos periféricos Fixe o cone FUS no transdutor usando parafusos e sele o cone com uma membrana de borracha flexível em um exaustor estéril ventilado. Encher o cone com a água desgaseificada e deionizada (DG-DI) do passo 1.3 e garantir a ausência de bolhas no cone para evitar cavitação. Use uma haste roscada personalizada para fixar o suporte impresso em 3D a um quadro (Figura 2B). Posicione o quadro de forma que a cabeça do transdutor FUS fique sobre o poço que será estimulado. Use um elástico para fixar o parafilme sobre o poço na placa MEA de 24 poços que contém o meio e os HiPSCs. Prepare o sistema FUS conectando a eletrônica do driver de back-end do transdutor de ultrassom, neste caso, a potência de saída do transdutor (TPO; Figura 3A), a uma tomada de 100-240 V (Figura 3B, Conexão 6) e conectando a rede correspondente ao TPO e ao transdutor FUS (Figura 3B, Conexão 1 e Conexão 2, respectivamente). A rede correspondente garante um acoplamento elétrico eficiente entre o transdutor e o TPO. Conecte o sistema MEA a uma tomada (100-240 V) (Figura 3B, Conexão 5). Conecte a porta de sincronização do sistema MEA ao TPO (Figura 3B, Conexão 3). Essa conexão sincronizará a aquisição de dados pelo sistema MEA com a estimulação do USF. Coloque a placa MEA de 24 poços no sistema MEA e remova a tampa para permitir o contato direto entre o transdutor e o poço. Colocar o transdutor 5-10 mm acima da placa do poço para permitir espaço para o gel de acoplamento desgaseificado, conforme descrito no passo 3.2 (Figura 3A e Figura 2B). 3. Estimulação e aquisição do sinal neuronal Defina os parâmetros FUS no painel de controle TPO (Tabela 1). Aplicar o gel de acoplamento por cima do parafilme e abaixar o transdutor FUS no gel de acoplamento, garantindo o contato com o gel com o mínimo de bolhas de ar (Figura 2A). Inicie a gravação do sistema MEA clicando no botão Iniciar na interface do usuário. Inicie a sonicação FUS pressionando o botão inferior direito no TPO (Figura 3A, Rótulo 7) e aguarde pelo menos 5 min entre cada rodada de sonicação para permitir que os neurônios retornem a um estado basal. Utilize o pulso de disparo gerado pelo sistema FUS para alinhar a sequência de estimulação do FUS ao registro MEA (Figura 3B, Conexão 3). 4. Processamento e análise de dados Transfira os dados do sistema MEA para o computador usando uma conexão USB (Figura 3B, Conexão 4). Inicie isso clicando no painel Configuração de experimento . Em seguida, escolha o tipo de dados que se deseja gravar. Neste caso, os picos brutos são recomendados. Finalmente, nomeie o arquivo e selecione o local desejado dentro da unidade de disco para concluir a transferência.Observação : as etapas a seguir podem ser executadas executando o script Python liberado no https://github.com/Rxliang/FUSNeuromod. Leia os dados de cada um dos 16 eletrodos. Aplique um filtro passa-banda Butterworth com uma largura de banda de 5 Hz a 3 kHz com uma ordem Butterworth de 8.NOTA: Para otimizar esses valores, é crucial levar em conta a taxa de disparo das células específicas e o número de células envolvidas. Multiplicando esses 2 valores, pode-se estimar a taxa de disparo geral da população celular no experimento. Aplique um filtro gaussiano com σ = 3 para suavizar o sinal.NOTA: O parâmetro pode ser otimizado com base nos valores recomendados do sistema MEA, pois a suavização excessiva pode resultar em distorção de dados após a aquisição, e pouca suavização introduziria ruído indesejado. Defina um limite para detectar os picos potenciais como 5 vezes o desvio padrão do sinal suavizado gaussiano. Calcule a taxa de disparo dividindo o número de picos registrados em uma janela de 50 ms em todos os 16 canais pelo comprimento da janela (ou seja, 50 ms). Desloque a janela ao longo do sinal para o próximo quadro e repita o cálculo da taxa de disparo (Figura 1 Suplementar). Analise o sinal lendo o tempo de sonicação FUS dos dados transferidos com base na mudança na taxa de disparo associada ao FUS. 5. Limpeza e reutilização de placas MEA multi-poços Uma vez concluídos os experimentos, use uma pipeta para remover cuidadosamente o meio dos poços na placa de poços múltiplos, tomando cuidado para evitar a superfície do eletrodo. Adicionar 2 mL de água DG-DI por poço. Aspirar e repetir uma vez. Para desalojar quaisquer células e detritos, adicione uma mistura de 1 g de detergente enzimático Terg-A-Zyme com 10 mL de água DG-DI estéril (0,3 mL por poço) à placa. Deixe incubar durante a noite à temperatura ambiente (TR). No dia seguinte, retirar a solução dos poços e enxaguar com 1 mL de água DG-DI estéril. Incubar a placa de poço múltiplo por 5-7 min e aspirar. Repita esta etapa 5 vezes. Adicionar 0,5 mL de água DG-DI estéril por poço. Registre a linha de base da placa de poço múltiplo limpa para validar se a placa MEA está limpa. Uma placa limpa deve apresentar padrões de ruído gaussianos com baixos valores de intensidade. Conservar a placa de poço múltiplo limpa a 4 °C até estar pronta para ser utilizada novamente. Troque a água em que os MEAs são armazenados pelo menos uma vez por mês.

Representative Results

Em resumo, apresentamos um protocolo que permite o monitoramento in vitro da neuromodulação por FUS utilizando neurônios cultivados a partir de HiPSCs. A plataforma geral do sistema para estimular neurônios induzidos por HiPSC e registrar as respostas elétricas correspondentes para análise está descrita na Figura 1. Este estudo enfoca a estimulação dos neurônios pelo USF e o registro das respostas elétricas em um sistema MEA, como mostra a Figura 2. Os componentes periféricos dos sistemas FUS e MEA e suas conexões estão ilustrados na Figura 3. A caracterização do ponto focal é realizada antes dos experimentos neuronais para garantir que o fundo do poço seja totalmente coberto pelo ponto focal FUS. A visualização do ponto focal em folhas termocrômicas, como mostra a Figura 4, deve ser realizada para avaliar o sistema USF. Após a caracterização do ponto focal, as etapas de pós-processamento, incluindo filtragem, limiarização e cálculo da taxa de disparo, devem ser realizadas, e estas estão resumidas na Figura 5 e na Figura 6. Esses passos são essenciais para recuperar sinais úteis filtrando o ruído do ambiente e, assim, obter informações sobre as alterações da atividade neuronal causadas pela FUS. Os gráficos de Raster na Figura 6A-B mostram os picos detectados em cada canal. Como todo o fundo do poço está dentro do ponto focal do transdutor de USF, espera-se que o FUS altere a taxa de disparo em todos os eletrodos. Essa mudança na taxa de disparo é visualizada no gráfico de velocidade de disparo mostrado na Figura 6C, que mostra que os parâmetros de estimulação escolhidos resultaram em um aumento na taxa de disparo neuronal. Especificamente, a taxa de disparo pré-FUS (ou seja, basal) foi de 140 Hz ± 116,7 Hz, enquanto a taxa de disparo pós-FUS foi de 786 Hz ± 419,4 Hz com FUS de onda contínua. Além disso, a Figura 6C mostra como a alteração dos parâmetros do FUS (por exemplo, usando FUS de onda pulsada em vez de onda contínua) pode alterar a magnitude da mudança na taxa de disparo, bem como alterar a quantidade de tempo antes que os neurônios retornem ao seu estado basal. O ultrassom focalizado de baixa intensidade (IFLI) não causa aquecimento significativo das culturas, principalmente quando comparado ao ultrassom focado de alta intensidade, que pretende atingir lesão térmica. A ausência de mudança de temperatura clinicamente impactante é apoiada por cálculos teóricos e simulações (Figura 2 Suplementar). Mesmo em casos extremos dos parâmetros experimentais do USF listados na Tabela 1, apenas um aumento mínimo de temperatura pôde ser observado de aproximadamente 0,04 °C. O uso de um gráfico de velocidade de disparo permite a quantificação dos efeitos neuromodulatórios do USF e pode ser usado para diferenciar entre respostas excitatórias e inibitórias. Uma vantagem significativa da placa MEA multipoço é que ela pode ser reutilizada várias vezes para estudar estados neuronais variados e parâmetros de estimulação de uma maneira de alto rendimento. Figura 1: Visão geral da plataforma in vitro para a neuromodulação de neurônios em um poço com ultrassom focalizado (FUS) e a medição de sua atividade neuronal usando um arranjo de microeletrodos. Cada eletrodo (linhas vermelhas, verdes e azuis) registra uma população de neurônios dentro de um único poço. Um pipeline de processamento é implementado para converter os registros elétricos neuronais brutos na detecção de padrões de disparo neuronal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Neuromodulação do FUS com arranjo de microeletrodos (MEA) multipoço . (A) Esquema do setup para neuromodulação do FUS com um MEA multi-poço. As ondas acústicas geradas pelo transdutor FUS propagam-se através de um cone de FUS preenchido com água desgaseificada e são acopladas com gel de ultrassom. O parafilme é fixado ao poço usando um elástico para evitar contaminação. A placa MEA envia gravações elétricas dos neurônios para o sistema MEA. (B) Uma fotografia do transdutor FUS na placa multipoço contida no sistema MEA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Configuração da plataforma in vitro . (A) A parte frontal da configuração da plataforma in vitro . A potência de saída do transdutor (TPO; esquerda) é usada para programar os parâmetros do FUS. O sistema MEA (direito) registra a atividade elétrica dos neurônios da placa do poço, que são neuromodulados pelo transdutor de USF. (B) A parte traseira da configuração da plataforma in vitro com conexões da rede de correspondência (1) ao TPO e (2) ao transdutor. (3) A conexão do sistema MEA ao TPO sincroniza a aquisição de dados. (4) A ligação do sistema MEA ao computador para transferência de dados. (5) A ligação eléctrica ao sistema MEA. (6) A conexão de energia ao sistema FUS. (7) O botão de sonicação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Caracterização do transdutor de USF. (A) Mapa de pressão do ponto focal utilizando os parâmetros do USF detalhados na Tabela 1 medidos pelo sistema AMPLITUDE15. (B) Pré e pós-sonicação de uma folha termocrômica colocada no fundo de um poço utilizando o arranjo experimental mostrado na Figura 3. A folha termocrômica muda de cor em resposta a mudanças de temperatura, o que fornece uma validação visual de estimulação bem-sucedida na localização dos neurônios. A intensidade média máxima do pulso de pico espacial (ISPPA) de 30 W/cm2 e a sonicação contínua de 3 min foram ajustadas para alterar drasticamente a temperatura local para melhor visualização deste ponto focal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: Pipeline de processamento. Passo 1: As gravações elétricas brutas são capturadas de N = 16 canais. As etapas futuras mostram o processo usando o canal 16 (descrito em vermelho). Passo 2: Para cada canal, um filtro passa-banda Butterworth (passa-banda de 5 Hz a 3 kHz) é aplicado, seguido por um filtro gaussiano (σ = 3). Um limiar é definido como cinco vezes o desvio padrão do sinal dentro de uma janela de 2 s centrada no início da sonicação. Passo 3: Sinais acima ou abaixo do limiar são caracterizados como picos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6: Gráficos de raster e taxa de disparo. (A) Gráfico raster dos picos detectados em cada canal em função do tempo de sonicação. O tempo de estimulação do USF é anotado por meio de uma linha vermelha. (B) Gráfico raster de neurônios sob diferentes configurações de FUS com FUS contínuo para comparação. (C) A taxa de disparo foi calculada usando uma janela deslizante de 50 ms. As taxas médias de disparo pré e pós-USF foram de 140 Hz e 786 Hz, respectivamente. Com fus pulsada, as taxas médias de disparo foram de 230 Hz e 540 Hz. Uma ativação mais curta e menor mudança de taxa foram induzidas por esse conjunto de estímulos variáveis do USF. O processo de cálculo da taxa de disparo está detalhado na Figura Suplementar 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Parâmetro Valor Potência máxima/ch. 1.200 W Patual 0,749 W/canal. ISPPA 10,79 W/cm2 EuSPTA 0,05 W/cm2 Comprimento de intermitência 0,100 ms Frequência 250,00 kHz Foco 39.800 milímetros Período 20.000 ms Temporizador 60.000 s Tabela 1: Parâmetros do ultrassom focalizado (FUS) fixados no TPO para o estudo apresentados na Figura 4. Figura suplementar 1: Processamento do gráfico Raster para a taxa de disparo. Passo 1: Conte os picos entre todos os canais para obter o número de contagem dentro de uma determinada janela deslizante. Nota: Aqui, uma janela deslizante maior (definida para 0,1 s) foi escolhida para melhor ilustração. Passo 2: Converta os picos por comprimento de janela em picos por segundo (por exemplo, aqui, multiplique as contagens por 10 para converter em hertz [Hz] e, em seguida, divida por 1.000 para obter o valor em kilohertz [kHz]). Passo 3: A curva de taxa de disparo adquirida como resultado. Um kit de ferramentas de código aberto, juntamente com dados de amostra, está disponível no GitHub (https://github.com/Rxliang/FUSNeuromod). Clique aqui para baixar este arquivo. Figura suplementar 2: Perfil de temperatura do resultado da simulação da onda K do LIFU16. Com base no mapa de intensidade acústica mostrado na Figura 4, o resultado da simulação da onda K sugere um aumento máximo de temperatura de 0,04 °C na região central da zona focal (raio: 2 mm) usando o caso extremo dos parâmetros experimentais do USF listados na Tabela 1. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Este manuscrito descreve um novo método que pode ser usado para registrar a atividade neuronal em HiPSCs durante a neuromodulação do USF. Este protocolo é generalizável para diferentes transdutores FUS e sistemas MEA. Para replicar os resultados observados com o protocolo descrito, o pesquisador deve garantir que o ponto focal do transdutor seja maior que a área do fundo do poço MEA. Além disso, se diferentes linhagens de células neuronais forem usadas, os parâmetros do filtro devem ser sintonizados com a resposta de frequência esperada para as células dentro do poço. Se resultados representativos não puderem ser alcançados, deve-se considerar a modificação dos parâmetros acima mencionados (por exemplo, o comprimento de ruptura, intensidade, ciclo de trabalho, etc.).

Embora este trabalho tenha demonstrado um aumento na taxa de disparo após a estimulação com USF, mais dados devem ser coletados para demonstrar a repetibilidade desse achado antes que qualquer conclusão seja tirada. Este protocolo herda as limitações dos sistemas MEA, que tipicamente apresentam fraquezas decorrentes do registro do sinal de corrente direta do microeletrodo. Embora o contato direto com o neurônio proporcione melhor sensibilidade, ele pode alterar a célula e afetar a precisão da medição. Além disso, devido ao pequeno tamanho dos poços, nosso sistema não inclui tecido periférico, que também pode desempenhar um papel na neuromodulação¹⁷. Isso pode limitar a aplicabilidade das conclusões tiradas dessa configuração para ambientes in vivo . Para estudar respostas de rede mais complexas, um sistema MEA de maior densidade de canais deve ser projetado para melhorar sua sensibilidade¹⁸. Várias direções futuras para esse sistema proposto foram identificadas, incluindo o uso de um pórtico 3D para segurar o transdutor e garantir a colocação precisa¹⁹. Melhorias adicionais poderiam ser feitas em relação ao algoritmo de pós-processamento, incluindo a utilização de um algoritmo de classificação de spiking²⁰ para classificar neurônios individuais. Esse processo seria benéfico para desembaraçar as respostas de neurônios multiunidades em estudos futuros sobre os mecanismos da FUS. Mais importante, é essencial incorporar modalidades adicionais de estimulação, como estímulos químicos, elétricos e ópticos, para elucidar os mecanismos subjacentes. Esses métodos podem alterar propriedades e comportamentos neuronais, como inibir canais iônicos específicos¹⁵ ou modificar as características da membrana²¹. Ao modular os principais fatores dentro da via de sinalização hipotética, os pesquisadores podem identificar as contribuições de cada fator em ambientes controlados e, finalmente, lançar luz sobre as interações complexas em jogo.

A estimulação elétrica²² é uma das técnicas mais consagradas para neuromodulação, com uma longa história de aplicações bem-sucedidas em ambientes clínicos e de pesquisa. Por outro lado, o USF e a optogenética²³ são modalidades relativamente novas que têm ganhado atenção nos últimos anos. As principais vantagens do USF são sua não invasividade e capacidade de estimular neurônios em profundidades que podem ser difíceis de alcançar com outras técnicas, incluindo estimulação elétrica e optogenética. Entretanto, assim como a optogenética²⁴, a USF apresenta algumas limitações relacionadas à modelagem da propagação da onda e das respostas neuronais associadas. Captar a complexidade das propriedades acústicas heterogêneas do tecido in vivo pode ser um desafio, o que leva a incertezas no campo de pressão e, consequentemente, nas respostas neuronais. Essa dificuldade em modelar com precisão essas propriedades representa um desafio ao otimizar a técnica para aplicações específicas do mundo real. As complexidades inerentes enfatizam a importância de sistemas in vitro como o deste estudo, pois possibilitam o estudo direto das respostas sob condições de intensidade acústica controlada.

Em conclusão, este sistema fornece uma plataforma in vitro de alto rendimento para estudar os efeitos neuromodulatórios do USF em neurônios humanos. Com esse sistema, os mecanismos de ação do USF podem ser explorados medindo-se as respostas elétricas dos neurônios humanos quando expostos a diferentes níveis e tipos de estimulação em ambiente controlado. Portanto, oferece uma valiosa ferramenta complementar aos modelos humanos e animais comumente utilizados no campo.

Materials

MEA System	Axion Biosystem Inc.	Maestro Edge	Sampling Rate: 11500 Hz
MEA Plate	Axion Biosystem Inc.	CytoView MEA	Electrode and Well: 16 electrodes in 24 wells
Well plate Interface	Amcor Inc.	Parafilm PM996; P7793	Thickness: 127 µm
CO2 Tank and Regulator for culture	AirGas Inc./ Harris Inc.	9296NC	Concentration: 5%
Culture Media	ThermoFisher Inc.	Laminin; 23017-015	Concentration: 1 µg/mL
HiPSC Neurons	Peprotech	CIPS and GM01582 Derived; 450-10	Concentration: 10 ng/mL (Refer Taga et al [2021]13)
Transducer	Sonic Concepts Inc.	CTX250; 008	Center Frequency: 250 kHz
Matching Network	Sonic Concepts Inc.	CTX250; NFS102v2	Impedance: 50 Ω
Transducer Power Output (TPO)	Sonic Concepts Inc.	Version 4.1; 020	Frequency: From 250 kHz to 2.5 MHz
Membrane	McMaster Inc.	Silicone Rubber; 5542N115	Thickness: 0.0127 cm
Coupling Gel	Parker Laboratory Inc.	Aquasonic 100; B08DDWG GXB	Viscosity: 130,000–185,000 cops
Connection to Probe holder	McMaster Inc.	Steal Threaded Rod; 90322A661	Length: 1–1/2" Long
Centrifuge	ThermoFisher Inc.	Sorvall Legend X1R; 75004261	Max acceleration: 10–25,830 x g
Hydrophone	Sonic Concepts Inc.	Y-104; 009	Range: 50 kHz–1.9 MHz
Water Tank	Sonic Concepts Inc.	WT	Size: 30 cm x 30 cm x 30 cm
Water Conditioning Unit	Sonic Concepts Inc.	WCU; SN006	Flow Velocity: 50 mL/s maximum
Oscilloscope	Rohde-Schwarz Inc.	RTC1002	Sampling rate: Up to 50 MHz
Stage	Sonic Concepts Inc.	MicroStage; 2	Accuracy: 1 µm
Thermochromic sheet	TIPTEMP Inc.	Liquid Crystal Sheet; TLCSEN337	Range: 22–24 °C
Computer	Microsoft Surface	Surface Pro	CPU i5 1035G4: 3.7 GHz
Data Transfer Software	Mathworks Inc.	MATLAB	Version 2021b
Processing Software	Python Software Foundation	Python	Version 3.7.10