मानव सफेनोस नस एंडोथेलियल सेल अलगाव और कतरनी तनाव और खिंचाव के नियंत्रित स्तर के संपर्क में
Summary
हम मानव सफेनोस नस एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचएसवीईसी) को अलग करने और कल्चर करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हम एचएसवीईसी में यांत्रिक तनाव का अध्ययन करने के लिए कतरनी तनाव और खिंचाव का उत्पादन करने के लिए विस्तृत तरीके भी प्रदान करते हैं।
Abstract
कोरोनरी धमनी बाईपास ग्राफ्ट (सीएबीजी) सर्जरी इस्केमिक मायोकार्डियम को पुनर्जीवित करने की एक प्रक्रिया है। धमनी नाली की तुलना में कम दीर्घकालिक पैटेंसी के बावजूद सफेनोस नस का उपयोग सीएबीजी नाली के रूप में किया जाता है। ग्राफ्ट धमनीकरण से जुड़े हेमोडायनामिक तनाव की अचानक वृद्धि के परिणामस्वरूप संवहनी क्षति, विशेष रूप से एंडोथेलियम, जो सफेनोस नस ग्राफ्ट (एसवीजी) की कम पैटेंसी को प्रभावित कर सकती है। यहां, हम मानव सफेनोस नस एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचएसवीईसी) के अलगाव, लक्षण वर्णन और विस्तार का वर्णन करते हैं। कोलेजनेस पाचन द्वारा पृथक कोशिकाएं विशिष्ट कोबलस्टोन आकृति विज्ञान प्रदर्शित करती हैं और एंडोथेलियल सेल मार्कर सीडी 31 और वीई-कैडरिन को व्यक्त करती हैं। यांत्रिक तनाव प्रभाव का आकलन करने के लिए, इस अध्ययन में दो मुख्य शारीरिक उत्तेजनाओं, कतरनी तनाव और खिंचाव की जांच करने के लिए प्रोटोकॉल का उपयोग किया गया था। एचएसवीईसी को कतरनी तनाव पैदा करने के लिए एक समानांतर प्लेट प्रवाह कक्ष में सुसंस्कृत किया जाता है, जो प्रवाह की दिशा में संरेखण दिखाता है और केएलएफ 2, केएलएफ 4 और एनओएस 3 की अभिव्यक्ति में वृद्धि करता है। एचएसवीईसी को सिलिकॉन झिल्ली में भी सुसंस्कृत किया जा सकता है जो शिरापरक (कम) और धमनी (उच्च) खिंचाव की नकल करते हुए नियंत्रित सेलुलर खिंचाव की अनुमति देता है। एंडोथेलियल कोशिकाओं के एफ-एक्टिन पैटर्न और नाइट्रिक ऑक्साइड (एनओ) स्राव को धमनी खिंचाव द्वारा तदनुसार संशोधित किया जाता है। सारांश में, हम एंडोथेलियल फेनोटाइप पर हेमोडायनामिक यांत्रिक तनाव के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एचएसवीईसी को अलग करने के लिए एक विस्तृत विधि प्रस्तुत करते हैं।
Introduction
एंडोथेलियल सेल (ईसी) डिसफंक्शन सफेनोस नस ग्राफ्ट विफलता 1,2,3,4 में एक महत्वपूर्ण खिलाड़ी है। कतरनी तनाव और चक्रीय खिंचाव की निरंतर वृद्धि मानव सफेनोस नस एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचएसवीईसी) 3,4,5,6 के प्रोइन्फ्लेमेटरी फेनोटाइप को प्रेरित करती है। अंतर्निहित आणविक मार्ग अभी भी पूरी तरह से समझ में नहीं आए हैं, और इन विट्रो अध्ययनों के लिए मानकीकृत प्रोटोकॉल क्षेत्र में नवीन अंतर्दृष्टि के प्रयासों का लाभ उठा सकते हैं। यहां, हम एचएसवीईसी को अलग करने, चिह्नित करने और विस्तारित करने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं और उन्हें शिरापरक और धमनी हेमोडायनामिक स्थितियों की नकल करते हुए कतरनी तनाव और चक्रीय खिंचाव के परिवर्तनीय स्तरों को कैसे उजागर किया जाए।
एचएसवीईसी को कोलेजनेज इनक्यूबेशन द्वारा अलग किया जाता है और इसका उपयोग 8 तक किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल को अन्य उपलब्ध प्रोटोकॉल7 की तुलना में पोत के कम हेरफेर की आवश्यकता होती है, जो चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट के साथ संदूषण को कम करता है। दूसरी ओर, कुशल ईसी निष्कर्षण के लिए कम से कम 2 सेमी के बड़े पोत खंड की आवश्यकता होती है। साहित्य में, यह बताया गया है कि बड़े जहाजों से ईसी को यांत्रिक हटाने 7,8 द्वारा भी प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि प्रभावी, भौतिक दृष्टिकोण में कम ईसी उपज और उच्च फाइब्रोब्लास्ट संदूषण के नुकसान हैं। शुद्धता बढ़ाने के लिए, चुंबकीय मोतियों या सेल सॉर्टिंग का उपयोग करके अतिरिक्त कदमों की आवश्यकता होती है, जिससे मोती और एंटीबॉडी 7,8 के अधिग्रहण के कारण प्रोटोकॉल की लागत बढ़ जाती है। एंजाइमेटिक विधि में ईसी शुद्धता और व्यवहार्यता 7,8 के बारे में तेज और बेहतर परिणाम हैं।
एंडोथेलियल डिसफंक्शन का अध्ययन करने के लिए सबसे अधिक बार इस्तेमाल किए जाने वाले ईसीएस मानव नाभि शिरा एंडोथेलियल कोशिकाएं (एचयूवीईसी) हैं। यह ज्ञात है कि ईसी फेनोटाइप विभिन्न संवहनी बिस्तरों में बदलता है, और उन तरीकों को विकसित करना आवश्यक है जो जांच के तहत पोत का प्रतिनिधित्व करते हैं 9,10। इस संबंध में, एचएसवीईसी को अलग करने और यांत्रिक तनाव के तहत इसे कल्चर करने के लिए एक प्रोटोकॉल की स्थापना नस ग्राफ्ट रोग में एचएसवीईसी शिथिलता के योगदान को समझने के लिए एक मूल्यवान उपकरण है।
Protocol
Representative Results
Discussion
एचएसवीईसी को सफलतापूर्वक अलग करने के लिए सफेनोस नस सेगमेंट कम से कम 2 सेमी होना चाहिए। कोशिकाओं को अलग करने के लिए कोलेजनेस समाधान को बनाए रखने के लिए पोत के सिरों को संभालना और बांधना मुश्किल होता है। ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
जेईके को फंडाको डी एम्पारो ए पेस्क्विसा डो एस्टाडो डी साओ पाउलो [एफएपीईएसपी-आईएनसीटी-20214/50889-7 और 2013/17368-0] और कॉन्सेलो नेशनल डी डेसेनवोल्विमेंटो साइंटिफिको और टेक्नोलोजिको-सीएनपीक्यू (आईएनसीटी-465586/2014-7 और 309179-2014-20) से अनुदान द्वारा समर्थित है। एएएम को फंडाको डी एम्पारो ए पेस्क्विसा डो एस्टाडो डी साओ पाउलो (एफएपीईएसपी 2015/11139-5) और कॉन्सेलो नेशनल डी डेसेनवोल्विमेंटो साइंटिफिको और टेक्नोलोजिको-सीएनपीक्यू (यूनिवर्सल – 407911/2021-9) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया है।
Materials
| 0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution | Gibco | 25200072 | |
| 15 µ slide I 0.4 Luer | Ibidi | 80176 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
| 6-wells equibiaxial loading station of 25 mm | Flexcell International Corporation | LS-3000B25.VJW | |
| 8-well chamber slide with removable well | Thermo Fisher Scientific | 154453 | |
| Acetic Acid (Glacial) | Millipore | 100063 | |
| Acrylic sheet 1 cm thick | Plexiglass | ||
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab24590 | |
| Anti-CD31, FITC antibody | Thermo Fisher Scientific | MHCD3101 | |
| Anti-VE-cadherin antibody | Cell Signaling | 2500 | |
| Bioflex plates collagen I | Flexcell International Corporation | BF3001C | |
| Bovine serum albumin solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm | Brasuture | AP524 | |
| Cyclophilin forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Cyclophilin reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| EBM-2 basal medium | Lonza | CC3156 | |
| EGM-2 SingleQuots supplements | Lonza | CC4176 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2657-029 | |
| Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX-5000T | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL | Blau Farmacêutica | SKU 68027 | |
| Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit) | Ibidi | 10902 | |
| KLF2 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF2 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF4 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF4 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| NOA 280 nitric oxide analyzer | Sievers Instruments | NOA-280i-1 | |
| NOS3 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| NOS3 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs | Ibidi | 10962 | |
| Phalloidin – Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Phalloidin – Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Potassium Iodide | Sigma-Aldrich | 221945 | |
| QuanTitec SYBR green PCR kit | Qiagen | 204143 | |
| QuantStudio 12K flex platform | Applied Biosystems | 4471087 | |
| RNeasy micro kit | Quiagen | 74004 | |
| Slide glass (24 mm x 60 mm) | Knittel Glass | VD12460Y1D.01 | |
| Sodium nitrite | Sigma-Aldrich | 31443 | |
| SuperScript IV first-strand synthesis system | Thermo Fisher Scientific | 18091200 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trypan blue stain 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| Type II collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C6885 |
References
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