בידוד תאי אנדותל של וריד ספנוס אנושי וחשיפה לרמות מבוקרות של לחץ גזירה ומתיחה
Summary
אנו מתארים פרוטוקול לבידוד ותרבית תאי אנדותל של ורידים ספניים אנושיים (hSVECs). אנו מספקים גם שיטות מפורטות לייצור לחץ גזירה ומתיחה כדי לחקור לחץ מכני ב- hSVECs.
Abstract
ניתוח השתלת מעקף עורקים כליליים (CABG) הוא הליך לחידוש שריר הלב האיסכמי. וריד ספנוס נשאר בשימוש כצינור CABG למרות הפטנט המופחת לטווח ארוך בהשוואה לצינורות עורקים. העלייה הפתאומית של מתח המודינמי הקשור לעורק השתל גורמת לנזק לכלי הדם, במיוחד לאנדותל, שעשוי להשפיע על הפטנט הנמוך של שתל הווריד הספנוס (SVG). במאמר זה אנו מתארים את הבידוד, האפיון וההרחבה של תאי אנדותל של ורידים ספניים אנושיים (hSVECs). תאים שבודדו על ידי עיכול collagenase מציגים את המורפולוגיה הטיפוסית של אבן מרוצפת ומבטאים סמני תאי אנדותל CD31 ו- VE-cadherin. כדי להעריך את השפעת הלחץ המכאני, נעשה שימוש בפרוטוקולים במחקר זה כדי לחקור את שני הגירויים הפיזיים העיקריים, לחץ גזירה ומתיחה, על SVGs עורקיים. hSVECs מתורבתים בתא זרימה מקביל של לוחות כדי לייצר לחץ גזירה, ומראים יישור בכיוון הזרימה וביטוי מוגבר של KLF2, KLF4 ו- NOS3. hSVECs ניתן גם לתרבית בקרום סיליקון המאפשר מתיחה תאית מבוקרת המחקה מתיחה ורידית (נמוכה) ועורקית (גבוהה). תבנית F-אקטין של תאי אנדותל והפרשת תחמוצת החנקן (NO) מווסתים בהתאם על ידי מתיחה עורקית. לסיכום, אנו מציגים שיטה מפורטת לבידוד hSVECs כדי לחקור את ההשפעה של לחץ מכני המודינמי על פנוטיפ אנדותל.
Introduction
תפקוד לקוי של תאי אנדותל (EC) הוא שחקן מפתח בכשל השתלת ורידים ספניים 1,2,3,4. העלייה המתמשכת של לחץ גזירה ומתיחה מחזורית גורמת לפנוטיפ פרו-דלקתי של תאי אנדותל ורידים ספנוסיים אנושיים (hSVECs)3,4,5,6. המסלולים המולקולריים הבסיסיים עדיין אינם מובנים במלואם, ופרוטוקולים סטנדרטיים למחקרי מבחנה עשויים למנף את המאמצים לתובנות חדשות בתחום. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול פשוט לבידוד, אפיון והרחבה של hSVECs וכיצד לחשוף אותם לרמות משתנות של לחץ גזירה ומתיחה מחזורית, המחקה את התנאים ההמודינמיים הורידיים והעורקים.
hSVECs מבודדים על ידי דגירה של collagenase וניתן להשתמש בהם עד מעבר 8. פרוטוקול זה דורש פחות מניפולציה של כלי הדם בהשוואה לפרוטוקולים הזמינים האחרים7, אשר מפחית זיהום עם תאי שריר חלק ופיברובלסטים. מצד שני, זה דורש קטע כלי גדול יותר של לפחות 2 ס”מ כדי לקבל מיצוי EC יעיל. בספרות, דווח כי ECs מכלי גדול ניתן להשיג גם על ידי הסרה מכנית 7,8. למרות יעילותה, לגישה הפיזית יש את החסרונות של תפוקת EC נמוכה וזיהום פיברובלסטים גבוה יותר. כדי להגביר את הטוהר, נדרשים צעדים נוספים באמצעות חרוזים מגנטיים או מיון תאים, מה שמגדיל את עלות הפרוטוקול עקב רכישת חרוזים ונוגדנים 7,8. לשיטה האנזימטית יש תוצאות מהירות וטובות יותר לגבי טוהר EC וכדאיות 7,8.
ECs הנפוצים ביותר לחקר תפקוד לקוי של האנדותל הם תאי אנדותל של ורידים טבוריים אנושיים (HUVECs). ידוע כי הפנוטיפ EC משתנה במיטות כלי דם שונות, וחיוני לפתח שיטות המייצגות את כלי השיט תחת חקירה 9,10. מבחינה זו, קביעת פרוטוקול לבידוד hSVEC ותרבית שלו תחת לחץ מכני היא כלי רב ערך להבנת התרומה של תפקוד לקוי של hSVEC במחלת השתלת ורידים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מקטע הוורידים הספנוס צריך להיות לפחות 2 ס”מ כדי לבודד בהצלחה hSVECs. מקטעים קטנים קשים לטיפול וקושרים את קצות כלי הדם כדי לשמור על תמיסת הקולגנאז לבידוד התאים. שטח הפנים המואר המצומצם אינו מניב מספיק תאים כדי להרחיב את התרבית. כדי למזער את הסיכון של זיהום עם שאינם ECs, מניפולציה של קטע הווריד saphen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JEK נתמך על ידי מענקים מ- Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 ו- 2013/17368-0] ו- Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 ו- 309179/2013-0). AAM נתמך על ידי מענקים של Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) ו- Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (אוניברסלי – 407911/2021-9).
Materials
| 0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution | Gibco | 25200072 | |
| 15 µ slide I 0.4 Luer | Ibidi | 80176 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
| 6-wells equibiaxial loading station of 25 mm | Flexcell International Corporation | LS-3000B25.VJW | |
| 8-well chamber slide with removable well | Thermo Fisher Scientific | 154453 | |
| Acetic Acid (Glacial) | Millipore | 100063 | |
| Acrylic sheet 1 cm thick | Plexiglass | ||
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab24590 | |
| Anti-CD31, FITC antibody | Thermo Fisher Scientific | MHCD3101 | |
| Anti-VE-cadherin antibody | Cell Signaling | 2500 | |
| Bioflex plates collagen I | Flexcell International Corporation | BF3001C | |
| Bovine serum albumin solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm | Brasuture | AP524 | |
| Cyclophilin forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Cyclophilin reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| EBM-2 basal medium | Lonza | CC3156 | |
| EGM-2 SingleQuots supplements | Lonza | CC4176 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2657-029 | |
| Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX-5000T | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL | Blau Farmacêutica | SKU 68027 | |
| Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit) | Ibidi | 10902 | |
| KLF2 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF2 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF4 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| KLF4 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| NOA 280 nitric oxide analyzer | Sievers Instruments | NOA-280i-1 | |
| NOS3 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| NOS3 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs | Ibidi | 10962 | |
| Phalloidin – Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Phalloidin – Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Potassium Iodide | Sigma-Aldrich | 221945 | |
| QuanTitec SYBR green PCR kit | Qiagen | 204143 | |
| QuantStudio 12K flex platform | Applied Biosystems | 4471087 | |
| RNeasy micro kit | Quiagen | 74004 | |
| Slide glass (24 mm x 60 mm) | Knittel Glass | VD12460Y1D.01 | |
| Sodium nitrite | Sigma-Aldrich | 31443 | |
| SuperScript IV first-strand synthesis system | Thermo Fisher Scientific | 18091200 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trypan blue stain 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| Type II collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C6885 |
References
- Allaire, E., Clowes, A. W. Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response. The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).
- Ali, M. H., Schumacker, P. T. Endothelial responses to mechanical stress: where is the mechanosensor. Critical Care Medicine. 30 (5), S198-S206 (2002).
- Ward, A. O., Caputo, M., Angelini, G. D., George, S. J., Zakkar, M. Activation and inflammation of the venous endothelium in vein graft disease. Atherosclerosis. 265, 266-274 (2017).
- Ward, A. O., et al. NF-κB inhibition prevents acute shear stress-induced inflammation in the saphenous vein graft endothelium. Scientific Reports. 10 (1), 15133 (2020).
- Golledge, J., Turner, R. J., Harley, S. L., Springall, D. R., Powell, J. T. Circumferential deformation and shear stress induce differential responses in saphenous vein endothelium exposed to arterial flow. The Journal of Clinical Investigation. 99 (11), 2719-2726 (1997).
- Girão-Silva, T., et al. High stretch induces endothelial dysfunction accompanied by oxidative stress and actin remodeling in human saphenous vein endothelial cells. Scientific Reports. 11 (1), 13493 (2021).
- Ataollahi, F., et al. New method for the isolation of endothelial cells from large vessels. Cytotherapy. 16 (8), 1145-1152 (2014).
- Torres, C., Machado, R., Lima, M. Flow cytometric characterization of the saphenous veins endothelial cells in patients with chronic venous disease and in patients undergoing bypass surgery: an exploratory study. Heart and Vessels. 35 (1), 1-13 (2020).
- Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds. Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).
- Jambusaria, A., et al. Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation. eLife. 9, e51413 (2020).
- Carneiro, A. P., Fonseca-Alaniz, M. H., Dallan, L. A. O., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. β-arrestin is critical for early shear stress-induced Akt/eNOS activation in human vascular endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 75-81 (2017).
- Davis, M. E., Cai, H., Drummond, G. R., Harrison, D. G. Stress regulates endothelial nitric oxide synthase expression through c-Src by divergent signaling pathways. Circulation Research. 89 (11), 1073-1080 (2001).
- Dekker, R. J., et al. Prolonged fluid shear stress induces a distinct set of endothelial cell genes, most specifically lung Kruppel-like factor (KLF2). Blood. 100 (5), 1689-1698 (2002).
- Hamik, A., et al. Kruppel-like factor 4 regulates endothelial inflammation. The Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13769-13779 (2007).
- Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (5), 467-491 (2010).
