Anrikning av naturliga och rekombinanta extracellulära vesiklar av mykobakterier

Summary

Detta protokoll beskriver anrikningen av inhemska mykobakteriella extracellulära vesiklar (mEV) från axeniska kulturer av Mycobacterium smegmatis (Msm) och hur mCherry (en röd fluorescerande reporter)-innehållande rekombinanta MsmEVs kan designas och anrikas. Slutligen verifieras det nya tillvägagångssättet genom anrikning av MsmEVs som innehåller EsxA-proteinet Mycobacterium tuberculosis.

Abstract

De flesta bakterier, inklusive mykobakterier, genererar extracellulära vesiklar (EV). Eftersom bakteriella EV (bEV) innehåller en delmängd av cellulära komponenter, inklusive metaboliter, lipider, proteiner och nukleinsyror, har flera grupper utvärderat antingen de ursprungliga eller rekombinanta versionerna av bEV för deras skyddande styrka som subenhetsvaccinkandidater. Till skillnad från inhemska elfordon är rekombinanta elfordon molekylärt konstruerade för att innehålla en eller flera immunogener av intresse. Under det senaste decenniet har olika grupper utforskat olika metoder för att generera rekombinanta bEV. Men här rapporterar vi design, konstruktion och anrikning av rekombinanta mykobakteriella EV (mEV) i mykobakterier. För att göra det använder vi Mycobacterium smegmatis (Msm), en fågelmykobakterie i jorden som modellsystem. Vi beskriver först generering och berikning av inhemska elbilar av MSM. Därefter beskriver vi design och konstruktion av rekombinanta mEV som innehåller antingen mCherry, ett rött fluorescerande reporterprotein, eller EsxA (Esat-6), en framträdande immunogen av Mycobacterium tuberculosis. Vi uppnår detta genom att separat smälta samman mCherry och EsxA N-termini med C-terminalen av ett litet Msm-protein Cfp-29. Cfp-29 är ett av de få rikligt förekommande proteinerna i MsmEV. Protokollet för att generera och anrika rekombinanta mEV från Msm förblir identiskt med generering och anrikning av inhemska EV av Msm.

Introduction

Trots utveckling och administrering av ett brett utbud av vacciner mot infektionssjukdomar sker än i dag ~30 % av alla dödsfall på grund av smittsamma sjukdomar^. Före tillkomsten av tuberkulosvaccinet (TBC) – Bacillus Calmette Guerin (BCG) – var tuberkulos den främsta dödsorsaken (~10 000 till 15 000/100 000 invånare)². Med administrering av BCG och enkel tillgång till första och andra linjens läkemedel mot tuberkulos har antalet tuberkulosrelaterade dödsfall dramatiskt minskat till ~1 miljon/år år 2022 (dvs. ~15-20/100 000 invånare¹). I tuberkulosendemiska populationer i världen fortsätter dock tuberkulosrelaterade dödsfall att ligga på ~100-550/100 000 invånare¹. Även om experter känner till flera orsaker som leder till dessa skeva siffror, verkar BCG-medierat skydd som inte varar ens under det första decenniet av livet vara den^{framträdande orsaken} 3,4,5,6,7. Med tanke på FN:s förnyade “mål för hållbar utveckling” och WHO:s strategi för att utrota tuberkulos finns det följaktligen en samlad global ansträngning för att utveckla ett mycket överlägset vaccinalternativ till BCG som kanske ger livslångt skydd mot tuberkulos.

För att uppnå detta mål utvärderar flera grupper för närvarande modifierade/rekombinanta BCG-stammar, icke-patogena och försvagade mykobakteriearter andra än BCG, och subenhetskandidater 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Vanligtvis är subenhetsvacciner liposomer som selektivt laddas med få renade (~1-6) fullängds- eller trunkerade immunogena proteiner av patogenen. Men på grund av deras falska veckning till icke-nativa konformationer och/eller slumpmässiga icke-funktionella interaktioner mellan de laddade proteinerna, saknar subenheter ofta nativa och germanska epitoper och misslyckas därför med att tillräckligt förbereda immunsystemet^14,19,20.

Följaktligen har extracellulära vesiklar (EV) av bakterier tagit fart som ett lovande alternativ 21,22,23,24,25,26. Vanligtvis innehåller bakteriella EV (bEV) en delmängd av deras cellulära komponenter, inklusive vissa delar av nukleinsyror, lipider och hundratals metaboliter och proteiner^27,28. Till skillnad från liposomer där ett fåtal renade proteiner är artificiellt laddade, innehåller bEVs hundratals naturligt laddade, naturligt veckade proteiner med en bättre benägenhet att förbereda immunsystemet, särskilt utan förstärkning/hjälp av adjuvans och Toll-like receptor (TLR) agonister^27,28,29. Det är inom denna forskningslinje som vi och andra har undersökt användbarheten av mykobakteriella EV som potentiella subenhetsförstärkare till BCG³⁰. Trots farhågor om att bEV saknar enhetliga antigenbelastningar har EV från försvagad Neisseria meningitidis framgångsrikt skyddat människor mot serogrupp B-meningokocker^31,32.

Åtminstone teoretiskt sett är de bästa elbilarna som kan öka BCG väl de elbilar som är berikade med patogena bakterier. Att berika EV som genereras av patogen mykobakterie är dock dyrt, tidskrävande och riskabelt. Dessutom kan patogengenererade EV vara mer virulenta än skyddande. Med tanke på de potentiella riskerna rapporterar vi här ett väl beprövat protokoll för anrikning av elbilar som genereras av axeniskt odlad Msm, en avirulent mycobacterium.

Trots att avirulenta mykobakterier kodar för flera patogena proteinortologer saknar de dock flera vaccinantigener/patogena proteinepitoper som är nödvändiga för att förbereda immunsystemet tillräckligt för skydd³³. Därför utforskade vi också att konstruera och berika rekombinanta EV av Msm genom molekylär ingenjörskonst, så att en betydande del av alla patogena proteiner av intresse som uttrycks och översätts i Msm, måste nå sina EVs. Vår hypotes var att ett eller flera av de 10 vanligaste proteinerna i Msm EV när de smälts samman med proteinet av intresse kommer att hjälpa till med en sådan translokation.

Medan vi började standardisera anrikningen av mykobakteriella EV (mEV) i vårt laboratorium, rapporterade Prados-Rosales et al. 2011 först visualisering och anrikning av mEV in vitro³⁰. Senare, 2014, publicerade samma grupp en modifierad version av sin metod³⁴ från 2011. År 2015 rapporterade Lee et al. också en oberoende standardiserad metod för mEV-anrikning igen från axeniska kulturer av mykobakterier³⁵. Genom att kombinera båda protokollen 34,35 och införliva några av våra modifieringar efter grundlig standardisering^, beskriver vi här ett protokoll som hjälper till att rutinmässigt berika mEV från axeniska kulturer av mykobakterier³⁶.

Här beskriver vi särskilt anrikningen av MSM-specifika EVs, vilket är en förlängning av ett publicerat protokoll³⁶ för anrikning av mykobakteriella EVs i allmänhet. Vi beskriver också hur man konstruerar rekombinanta mEVs (R-mEVs) som innehåller mCherry-proteinet (som en röd fluorescerande reporter) och EsxA (Esat-6)^37,38,39, en dominerande immunogen och en potentiell subenhetsvaccinogen av Mycobacterium tuberculosis. Protokollet för att berika R-mEV:erna förblir identiskt med det vi har beskrivit för att berika inhemska EV:er från Msm.

Protocol

1. Tillväxtbetingelser för Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli och deras derivat MediaMiddlebrook 7H9 flytande buljongBered 20 % Tween-80 stamlösning genom att förvärma erforderlig volym dubbeldestillerat vatten (ddw) i en glasbägare till ~45-50 oC i mikrovågsugn, tillsätt erforderlig volym Tween-80 med hjälp av en lämplig mätcylinder och rör om kontinuerligt på en liten magnetomrörare för att f…

Representative Results

Vi använder M. smegmatis (Msm) som modell mykobakterie för att demonstrera anrikning av både nativa och rekombinanta mEV (R-mEV). Detta schematiskt sammanfattade mEV-anrikningsprotokoll (figur 1) fungerar också för anrikning av R-mEV av Msm och nativa EV av Mtb (med mindre modifieringar som i protokollanteckningar från 1.2). Visualisering av de anrikade mEV:erna kräver negativ färgning av dem under ett transmissionselektronmikroskop36 (<strong class="…

Discussion

Eftersom det fortfarande är en formidabel utmaning att utveckla ett nytt tuberkulosvaccin som är överlägset och kan ersätta BCG, strävar flera grupper som ett alternativ efter upptäckten av olika subenhetsvacciner mot tuberkulos som kan öka BCG:s styrka och förlänga dess skyddstid^48,49. Med tanke på den ökande uppmärksamheten på bakteriella EV (bEVs) som potentiella subenheter och som naturliga adjuvans^50,51,<sup c…

Materials

A2 type Biosafety Cabinet	Thermo Fisher Scientific, USA		1300 series
Bench top Centrifuge	Eppendorf, USA		5810 R
BstB1, HindIII, HpaI	NEB, USA		NEB
Cell densitometer	GE Healthcare, USA		Ultraspec 10
Citric Acid	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Dibasic Potassium Phosphate	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Double Distilled Water	Merck, USA		~18.2 MW/cm @ 25 oC
Electroporation cuvettes	Bio-Rad, USA		2 mm
Electroporator	Bio-Rad, USA		Electroporator
EsxA-specific Ab	Abcam, UK		Rabbit polyclonal
Ferric Ammonium Citrate	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Floor model centrifuge	Thermo Fisher Scientific, USA		Sorvall RC6 plus
Glassware	Borosil, INDIA		1 L Erlenmeyer flasks
Glycerol	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
HEPES and Sodium Chloride	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Incubator shakers	Thermo Fisher Scientific, USA		MaxQ 6000 & 8000
L-Asparagine	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Luria Bertani Broth and Agar, Miller	Hi Media, INDIA		Hi Media
Magnesium Sulfate Heptahydrate	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Magnetic stirrer	Tarsons, INDIA		Tarsons
mCherry-specific Ab	Abcam, UK		Rabbit monoclonal
Microwave	LG, INDIA		MC3286BLT
Middlebrook 7H9 Broth	BD, USA		Difco Middlebrook 7H9 Broth
Middlebrook ADC enrichment	BD, USA		BBL Middlebrook ADC enrichment
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific, USA		Spectronic 200 UV-Vis
NEB5a	NEB, USA		a derivative of DH5a
Optiprep (Iodixanol)	Merck, USA		Available as 60% stock solution (in water)
PCR purification kit	Hi Media, INDIA		Hi Media
pH Meter	Mettler Toledo, USA		Mettler Toledo
Plasmid DNA mini kit	Hi Media, INDIA		Hi Media
Plate incubator	Thermo Fisher Scientific, USA		New Series
Plasmid pMV261	Addgene, USA * *The   plasmid   is   no   more available in this plasmid bank		Shuttle vector
Proof-reading DNA Polymerase	Thermo Fisher Scientific, USA		Phusion DNA Plus Polymerase
Q5 Proof-reading DNA Polymerase	NEB, USA		NEB
Refrigerated circulating water bath	Thermo Fisher Scientific, USA		R20
Middlebrock 7H11 Agar base	BD, USA		BBL Seven H11 Agar base
SOC broth	Hi Media, INDIA		Hi Media
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
T4 DNA Ligase	NEB, USA		NEB
Tween-80	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Ultracentrifuge	Beckman Coulter, USA		Optima L100K
Ultracentrifuge tubes – 14 mL	Beckman Coulter, USA		Polyallomer type – ultra clear type in SW40Ti rotor
Ultracentrifuge tubes – 38 mL	Beckman Coulter, USA		Polypropylene type– cloudy type for SW28 rotor
Ultrasonics cleaning waterbath sonicator	Thermo Fisher Scientific, USA		Sonicator – bench top model
0.22 µm Disposable filters	Thermo Fisher Scientific, USA		Nunc-Nalgene
30-kDa Centricon concentrators	Merck, USA		Amicon Ultra centrifugal filters – Millipore
3X FLAG antibody	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
400 mL Centrifuge bottles	Thermo Fisher Scientific, USA		Nunc-Nalgene
50 mL Centrifuge tubes	Corning, USA		Sterile, pre-packed
Bacteria
Strain
Escherichia coli	NEB, USA		NEB 5-alpha (a derivative of DH5α).
Msm expressing cfp29::mCherry	This study		MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA	This study		MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG	This study		MC2 155
Mycobacterium smegmatis (Msm)	Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA		MC2 155