Questo protocollo descrive in dettaglio l’arricchimento di vescicole extracellulari micobatteriche native (mEV) da colture axeniche di Mycobacterium smegmatis (Msm) e come possono essere progettate e arricchite le MsmEV ricombinanti contenenti mCherry (un reporter fluorescente rosso). Infine, verifica il nuovo approccio con l’arricchimento di MsmEVs contenenti la proteina EsxA di Mycobacterium tuberculosis.
La maggior parte dei batteri, compresi i micobatteri, genera vescicole extracellulari (EV). Poiché le vescicole extracellulari batteriche (bEV) contengono un sottoinsieme di componenti cellulari, tra cui metaboliti, lipidi, proteine e acidi nucleici, diversi gruppi hanno valutato le versioni native o ricombinanti delle bEV per la loro potenza protettiva come candidati vaccini a subunità. A differenza delle vescicole extracellulari native, le vescicole extracellulari ricombinanti sono molecolarmente ingegnerizzate per contenere uno o più immunogeni di interesse. Nell’ultimo decennio, diversi gruppi hanno esplorato diversi approcci per la generazione di bEV ricombinanti. Tuttavia, qui, riportiamo la progettazione, la costruzione e l’arricchimento di vescicole extracellulari micobatteriche ricombinanti (mEV) nei micobatteri. A tal fine, utilizziamo Mycobacterium smegmatis (Msm), un micobatterio avirulento del suolo come sistema modello. Per prima cosa descriviamo la generazione e l’arricchimento di vescicole extracellulari native di Msm. Quindi, descriviamo la progettazione e la costruzione di mEV ricombinanti che contengono mCherry, una proteina reporter fluorescente rossa, o EsxA (Esat-6), un importante immunogeno di Mycobacterium tuberculosis. Raggiungiamo questo risultato fondendo separatamente mCherry ed EsxA N-termini con il C-terminale di una piccola proteina Msm Cfp-29. Cfp-29 è una delle poche proteine abbondantemente presenti delle MsmEV. Il protocollo per generare e arricchire mEV ricombinanti da Msm rimane identico alla generazione e all’arricchimento di EV native di Msm.
Nonostante lo sviluppo e la somministrazione di un’ampia gamma di vaccini contro le malattie infettive, ancora oggi, ~30% di tutti i decessi umani si verifica ancora a causadi malattie trasmissibili. Prima dell’avvento del vaccino contro la tubercolosi (TB) – Bacillus Calmette Guerin (BCG) – la tubercolosi era il killer numero uno (~10.000-15.000/100.000 abitanti)2. Con la somministrazione di BCG e il facile accesso ai farmaci antitubercolari di prima e seconda linea, entro il 2022, i decessi correlati alla tubercolosi sono drasticamente scesi a ~ 1 milione / anno entro il 2022 (cioè, ~ 15-20/100.000 popolazione1). Tuttavia, nelle popolazioni endemiche di tubercolosi del mondo, i decessi correlati alla tubercolosi continuano a attestarsi a ~100-550/100.000 abitanti1. Sebbene gli esperti riconoscano diverse ragioni che portano a questi numeri distorti, la protezione mediata da BCG che non dura nemmeno per la prima decade di vita sembra essere la ragione principale 3,4,5,6,7. Di conseguenza, dati i rinnovati “Obiettivi di Sviluppo Sostenibile” delle Nazioni Unite e la “Strategia End TB” dell’OMS, c’è uno sforzo globale concertato per sviluppare un vaccino alternativo molto superiore al BCG che forse fornisca una protezione permanente dalla tubercolosi.
A tal fine, diversi gruppi stanno attualmente valutando ceppi di BCG modificati/ricombinanti, specie micobatteriche non patogene e attenuate diverse dal BCG e candidati subunità 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Tipicamente, i vaccini a subunità sono liposomi caricati selettivamente con poche proteine immunogeniche purificate (~1-6) a lunghezza intera o troncate del patogeno. Tuttavia, a causa del loro ripiegamento spurio in conformazioni non native e/o interazioni casuali non funzionali tra le proteine caricate, le subunità spesso mancano di epitopi nativi e germanici e, quindi, non riescono a innescare sufficientemente il sistema immunitario14,19,20.
Di conseguenza, le vescicole extracellulari (EV) dei batteri hanno preso piede come alternativa promettente 21,22,23,24,25,26. Tipicamente, le vescicole extracellulari batteriche (bEV) contengono un sottoinsieme dei loro componenti cellulari, tra cui alcune porzioni di acidi nucleici, lipidi e centinaia di metaboliti e proteine27,28. A differenza dei liposomi in cui poche proteine purificate sono caricate artificialmente, le bEV contengono centinaia di proteine caricate naturalmente e ripiegate in modo nativo con una migliore propensione a innescare il sistema immunitario, specialmente senza la spinta / aiuto di adiuvanti e agonisti del recettore Toll-like (TLR)27,28,29. È in questa linea di ricerca che noi e altri abbiamo esplorato l’utilità delle vescicole extracellulari micobatteriche come potenziali booster di subunità per BCG30. Nonostante le preoccupazioni che le vescicole extracellulari manchino di carichi antigenici uniformi, le vescicole extracellulari di Neisseria meningitidis attenuata hanno protetto con successo gli esseri umani contro il meningococco di sierogruppoB 31,32.
Almeno in teoria, le migliori vescicole extracellulari che potrebbero aumentare bene il BCG sono le vescicole extracellulari arricchite da batteri patogeni. Tuttavia, l’arricchimento delle vescicole extracellulari generate da micobatteri patogeni è costoso, dispendioso in termini di tempo e rischioso. Inoltre, le vescicole extracellulari generate da agenti patogeni possono essere più virulente che protettive. Dati i potenziali rischi, riportiamo qui un protocollo ben collaudato per l’arricchimento di vescicole extracellulari generate da Msm coltivato assinicamente, un micobatterio avirulento.
Tuttavia, nonostante codifichino diversi ortologhi di proteine patogene, i micobatteri avirulenti mancano di diversi antigeni vaccinali/epitopi proteici patogeni necessari per preparare sufficientemente il sistema immunitario verso la protezione33. Pertanto, abbiamo anche esplorato la costruzione e l’arricchimento di vescicole extracellulari ricombinanti di Msm attraverso l’ingegneria molecolare, in modo tale che una porzione significativa di qualsiasi proteina patogena di interesse espressa e tradotta in Msm, debba raggiungere le sue vescicole extracellulari. Abbiamo ipotizzato che una o più delle prime 10 proteine abbondanti delle vescicole extracellulari Msm, una volta fuse con la proteina di interesse, aiutino in tale traslocazione.
Mentre stavamo iniziando a standardizzare l’arricchimento delle vescicole extracellulari micobatteriche (mEV) nel nostro laboratorio, nel 2011, Prados-Rosales et al. hanno riportato per la prima volta la visualizzazione e l’arricchimento delle mEV in vitro30. Successivamente, nel 2014, lo stesso gruppo ha pubblicato una versione modificata del metodo34 del 2011. Nel 2015, Lee et al. hanno anche riportato un metodo standardizzato in modo indipendente per l’arricchimento di mEV sempre da colture axeniche di micobatteri35. Combinando entrambi i protocolli34,35 e incorporando alcune delle nostre modifiche dopo un’accurata standardizzazione, descriviamo qui un protocollo che aiuta ad arricchire regolarmente le mEV da colture axeniche di micobatteri36.
Qui, descriviamo in dettaglio l’arricchimento delle vescicole extracellulari specifiche per Msm, che è un’estensione di un protocollopubblicato 36 per l’arricchimento delle vescicole extracellulari micobatteriche in generale. Descriviamo anche in dettaglio come costruire mEV ricombinanti (R-mEVs) che contengono la proteina mCherry (come reporter fluorescente rosso) ed EsxA (Esat-6)37,38,39, un immunogeno predominante e una potenziale subunità vaccinogeno di Mycobacterium tuberculosis. Il protocollo per l’arricchimento delle R-mEV rimane identico a quello che abbiamo descritto per l’arricchimento delle EV native da Msm.
Poiché lo sviluppo di un nuovo vaccino contro la tubercolosi che sia superiore e in grado di sostituire il BCG rimane una sfida formidabile, in alternativa, diversi gruppi stanno perseguendo la scoperta di diversi vaccini contro la tubercolosi a subunità che possano aumentare la potenza del BCG e prolungarne la durata protettiva48,49. Data la crescente attenzione alle vescicole extracellulari batteriche (bEV) come potenziali subunità e come adiuvanti naturali<…
The authors have nothing to disclose.
Gli autori ringraziano sinceramente la Prof.ssa Sarah M. Fortune per aver gentilmente condiviso le scorte di M. smegmatis mc2155. Riconoscono inoltre a Servier Medical Art (smart.servier.com) di aver fornito alcuni elementi di base per la Figura 1. Riconoscono sinceramente il supporto del resto dei membri del laboratorio per le regolazioni dei loro pazienti durante il lungo uso degli agitatori dell’incubatore, delle centrifughe e delle ultracentrifughe per l’arricchimento mEV. Riconoscono anche il signor Surjeet Yadav, l’assistente di laboratorio, per essersi sempre assicurato che la vetreria e i materiali di consumo necessari fossero sempre disponibili e a portata di mano. Infine, ringraziano i team amministrativi, di acquisto e finanziari di THSTI per il loro costante supporto e aiuto nell’esecuzione senza soluzione di continuità del progetto.
A2 type Biosafety Cabinet | Thermo Fisher Scientific, USA | 1300 series | |
Bench top Centrifuge | Eppendorf, USA | 5810 R | |
BstB1, HindIII, HpaI | NEB, USA | NEB | |
Cell densitometer | GE Healthcare, USA | Ultraspec 10 | |
Citric Acid | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
Dibasic Potassium Phosphate | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
Double Distilled Water | Merck, USA | ~18.2 MW/cm @ 25 oC | |
Electroporation cuvettes | Bio-Rad, USA | 2 mm | |
Electroporator | Bio-Rad, USA | Electroporator | |
EsxA-specific Ab | Abcam, UK | Rabbit polyclonal | |
Ferric Ammonium Citrate | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
Floor model centrifuge | Thermo Fisher Scientific, USA | Sorvall RC6 plus | |
Glassware | Borosil, INDIA | 1 L Erlenmeyer flasks | |
Glycerol | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
HEPES and Sodium Chloride | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
Incubator shakers | Thermo Fisher Scientific, USA | MaxQ 6000 & 8000 | |
L-Asparagine | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
Luria Bertani Broth and Agar, Miller | Hi Media, INDIA | Hi Media | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
Magnetic stirrer | Tarsons, INDIA | Tarsons | |
mCherry-specific Ab | Abcam, UK | Rabbit monoclonal | |
Microwave | LG, INDIA | MC3286BLT | |
Middlebrook 7H9 Broth | BD, USA | Difco Middlebrook 7H9 Broth | |
Middlebrook ADC enrichment | BD, USA | BBL Middlebrook ADC enrichment | |
Nanodrop | Thermo Fisher Scientific, USA | Spectronic 200 UV-Vis | |
NEB5a | NEB, USA | a derivative of DH5a | |
Optiprep (Iodixanol) | Merck, USA | Available as 60% stock solution (in water) | |
PCR purification kit | Hi Media, INDIA | Hi Media | |
pH Meter | Mettler Toledo, USA | Mettler Toledo | |
Plasmid DNA mini kit | Hi Media, INDIA | Hi Media | |
Plate incubator | Thermo Fisher Scientific, USA | New Series | |
Plasmid pMV261 | Addgene, USA * *The plasmid is no more available in this plasmid bank |
Shuttle vector | |
Proof-reading DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific, USA | Phusion DNA Plus Polymerase | |
Q5 Proof-reading DNA Polymerase | NEB, USA | NEB | |
Refrigerated circulating water bath | Thermo Fisher Scientific, USA | R20 | |
Middlebrock 7H11 Agar base | BD, USA | BBL Seven H11 Agar base | |
SOC broth | Hi Media, INDIA | Hi Media | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
T4 DNA Ligase | NEB, USA | NEB | |
Tween-80 | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter, USA | Optima L100K | |
Ultracentrifuge tubes – 14 mL | Beckman Coulter, USA | Polyallomer type – ultra clear type in SW40Ti rotor | |
Ultracentrifuge tubes – 38 mL | Beckman Coulter, USA | Polypropylene type– cloudy type for SW28 rotor | |
Ultrasonics cleaning waterbath sonicator | Thermo Fisher Scientific, USA | Sonicator – bench top model | |
0.22 µm Disposable filters | Thermo Fisher Scientific, USA | Nunc-Nalgene | |
30-kDa Centricon concentrators | Merck, USA | Amicon Ultra centrifugal filters – Millipore | |
3X FLAG antibody | Sigma-Aldrich, Merck, USA | Sigma Aldrich | |
400 mL Centrifuge bottles | Thermo Fisher Scientific, USA | Nunc-Nalgene | |
50 mL Centrifuge tubes | Corning, USA | Sterile, pre-packed | |
Bacteria | |||
Strain | |||
Escherichia coli | NEB, USA | NEB 5-alpha (a derivative of DH5α). | |
Msm expressing cfp29::mCherry | This study | MC2 155 | |
Msm expressing cfp29::esxA | This study | MC2 155 | |
Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG | This study | MC2 155 | |
Mycobacterium smegmatis (Msm) | Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA | MC2 155 |