Arricchimento di vescicole extracellulari native e ricombinanti di micobatteri

Summary

Questo protocollo descrive in dettaglio l’arricchimento di vescicole extracellulari micobatteriche native (mEV) da colture axeniche di Mycobacterium smegmatis (Msm) e come possono essere progettate e arricchite le MsmEV ricombinanti contenenti mCherry (un reporter fluorescente rosso). Infine, verifica il nuovo approccio con l’arricchimento di MsmEVs contenenti la proteina EsxA di Mycobacterium tuberculosis.

Abstract

La maggior parte dei batteri, compresi i micobatteri, genera vescicole extracellulari (EV). Poiché le vescicole extracellulari batteriche (bEV) contengono un sottoinsieme di componenti cellulari, tra cui metaboliti, lipidi, proteine e acidi nucleici, diversi gruppi hanno valutato le versioni native o ricombinanti delle bEV per la loro potenza protettiva come candidati vaccini a subunità. A differenza delle vescicole extracellulari native, le vescicole extracellulari ricombinanti sono molecolarmente ingegnerizzate per contenere uno o più immunogeni di interesse. Nell’ultimo decennio, diversi gruppi hanno esplorato diversi approcci per la generazione di bEV ricombinanti. Tuttavia, qui, riportiamo la progettazione, la costruzione e l’arricchimento di vescicole extracellulari micobatteriche ricombinanti (mEV) nei micobatteri. A tal fine, utilizziamo Mycobacterium smegmatis (Msm), un micobatterio avirulento del suolo come sistema modello. Per prima cosa descriviamo la generazione e l’arricchimento di vescicole extracellulari native di Msm. Quindi, descriviamo la progettazione e la costruzione di mEV ricombinanti che contengono mCherry, una proteina reporter fluorescente rossa, o EsxA (Esat-6), un importante immunogeno di Mycobacterium tuberculosis. Raggiungiamo questo risultato fondendo separatamente mCherry ed EsxA N-termini con il C-terminale di una piccola proteina Msm Cfp-29. Cfp-29 è una delle poche proteine abbondantemente presenti delle MsmEV. Il protocollo per generare e arricchire mEV ricombinanti da Msm rimane identico alla generazione e all’arricchimento di EV native di Msm.

Introduction

Nonostante lo sviluppo e la somministrazione di un’ampia gamma di vaccini contro le malattie infettive, ancora oggi, ~30% di tutti i decessi umani si verifica ancora a causa^{di malattie} trasmissibili. Prima dell’avvento del vaccino contro la tubercolosi (TB) – Bacillus Calmette Guerin (BCG) – la tubercolosi era il killer numero uno (~10.000-15.000/100.000 abitanti)². Con la somministrazione di BCG e il facile accesso ai farmaci antitubercolari di prima e seconda linea, entro il 2022, i decessi correlati alla tubercolosi sono drasticamente scesi a ~ 1 milione / anno entro il 2022 (cioè, ~ 15-20/100.000 popolazione¹). Tuttavia, nelle popolazioni endemiche di tubercolosi del mondo, i decessi correlati alla tubercolosi continuano a attestarsi a ~100-550/100.000 abitanti¹. Sebbene gli esperti riconoscano diverse ragioni che portano a questi numeri distorti, la protezione mediata da BCG che non dura nemmeno per la prima decade di vita sembra essere la ragione principale 3,4,5,6,7. Di conseguenza, dati i rinnovati “Obiettivi di Sviluppo Sostenibile” delle Nazioni Unite e la “Strategia End TB” dell’OMS, c’è uno sforzo globale concertato per sviluppare un vaccino alternativo molto superiore al BCG che forse fornisca una protezione permanente dalla tubercolosi.

A tal fine, diversi gruppi stanno attualmente valutando ceppi di BCG modificati/ricombinanti, specie micobatteriche non patogene e attenuate diverse dal BCG e candidati subunità 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Tipicamente, i vaccini a subunità sono liposomi caricati selettivamente con poche proteine immunogeniche purificate (~1-6) a lunghezza intera o troncate del patogeno. Tuttavia, a causa del loro ripiegamento spurio in conformazioni non native e/o interazioni casuali non funzionali tra le proteine caricate, le subunità spesso mancano di epitopi nativi e germanici e, quindi, non riescono a innescare sufficientemente il sistema immunitario^14,19,20.

Di conseguenza, le vescicole extracellulari (EV) dei batteri hanno preso piede come alternativa promettente 21,22,23,24,25,26. Tipicamente, le vescicole extracellulari batteriche (bEV) contengono un sottoinsieme dei loro componenti cellulari, tra cui alcune porzioni di acidi nucleici, lipidi e centinaia di metaboliti e proteine^27,28. A differenza dei liposomi in cui poche proteine purificate sono caricate artificialmente, le bEV contengono centinaia di proteine caricate naturalmente e ripiegate in modo nativo con una migliore propensione a innescare il sistema immunitario, specialmente senza la spinta / aiuto di adiuvanti e agonisti del recettore Toll-like (TLR)^27,28,29. È in questa linea di ricerca che noi e altri abbiamo esplorato l’utilità delle vescicole extracellulari micobatteriche come potenziali booster di subunità per BCG³⁰. Nonostante le preoccupazioni che le vescicole extracellulari manchino di carichi antigenici uniformi, le vescicole extracellulari di Neisseria meningitidis attenuata hanno protetto con successo gli esseri umani contro il meningococco di sierogruppo^{B 31,32}.

Almeno in teoria, le migliori vescicole extracellulari che potrebbero aumentare bene il BCG sono le vescicole extracellulari arricchite da batteri patogeni. Tuttavia, l’arricchimento delle vescicole extracellulari generate da micobatteri patogeni è costoso, dispendioso in termini di tempo e rischioso. Inoltre, le vescicole extracellulari generate da agenti patogeni possono essere più virulente che protettive. Dati i potenziali rischi, riportiamo qui un protocollo ben collaudato per l’arricchimento di vescicole extracellulari generate da Msm coltivato assinicamente, un micobatterio avirulento.

Tuttavia, nonostante codifichino diversi ortologhi di proteine patogene, i micobatteri avirulenti mancano di diversi antigeni vaccinali/epitopi proteici patogeni necessari per preparare sufficientemente il sistema immunitario verso la protezione³³. Pertanto, abbiamo anche esplorato la costruzione e l’arricchimento di vescicole extracellulari ricombinanti di Msm attraverso l’ingegneria molecolare, in modo tale che una porzione significativa di qualsiasi proteina patogena di interesse espressa e tradotta in Msm, debba raggiungere le sue vescicole extracellulari. Abbiamo ipotizzato che una o più delle prime 10 proteine abbondanti delle vescicole extracellulari Msm, una volta fuse con la proteina di interesse, aiutino in tale traslocazione.

Mentre stavamo iniziando a standardizzare l’arricchimento delle vescicole extracellulari micobatteriche (mEV) nel nostro laboratorio, nel 2011, Prados-Rosales et al. hanno riportato per la prima volta la visualizzazione e l’arricchimento delle mEV in vitro³⁰. Successivamente, nel 2014, lo stesso gruppo ha pubblicato una versione modificata del metodo³⁴ del 2011. Nel 2015, Lee et al. hanno anche riportato un metodo standardizzato in modo indipendente per l’arricchimento di mEV sempre da colture axeniche di micobatteri³⁵. Combinando entrambi i protocolli^34,35 e incorporando alcune delle nostre modifiche dopo un’accurata standardizzazione^, descriviamo qui un protocollo che aiuta ad arricchire regolarmente le mEV da colture axeniche di micobatteri³⁶.

Qui, descriviamo in dettaglio l’arricchimento delle vescicole extracellulari specifiche per Msm, che è un’estensione di un protocollo^{pubblicato 36} per l’arricchimento delle vescicole extracellulari micobatteriche in generale. Descriviamo anche in dettaglio come costruire mEV ricombinanti (R-mEVs) che contengono la proteina mCherry (come reporter fluorescente rosso) ed EsxA (Esat-6)^37,38,39, un immunogeno predominante e una potenziale subunità vaccinogeno di Mycobacterium tuberculosis. Il protocollo per l’arricchimento delle R-mEV rimane identico a quello che abbiamo descritto per l’arricchimento delle EV native da Msm.

Protocol

1. Condizioni di crescita di Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli e loro derivati MediaBrodo liquido Middlebrook 7H9Preparare la soluzione madre Tween-80 al 20% preriscaldando il volume richiesto di acqua bidistillata (ddw) in un bicchiere di vetro a ~45-50 oC in un microonde, aggiungere il volume richiesto di Tween-80 utilizzando un cilindro graduato appropriato e agitare continuamente su un piccolo agitatore m…

Representative Results

Utilizziamo M. smegmatis (Msm) come micobatterio modello per dimostrare l’arricchimento di mEV sia native che ricombinanti (R-mEV). Questo protocollo di arricchimento di mEV schematicamente riassunto (Figura 1) funziona anche per l’arricchimento di R-mEV di Msm e EV nativi di Mtb (con piccole modifiche come nelle note di protocollo di 1.2). La visualizzazione delle mEV arricchite richiede la loro colorazione negativa al microscopio elettronicoa trasmissione 36</sup…

Discussion

Poiché lo sviluppo di un nuovo vaccino contro la tubercolosi che sia superiore e in grado di sostituire il BCG rimane una sfida formidabile, in alternativa, diversi gruppi stanno perseguendo la scoperta di diversi vaccini contro la tubercolosi a subunità che possano aumentare la potenza del BCG e prolungarne la durata protettiva^48,49. Data la crescente attenzione alle vescicole extracellulari batteriche (bEV) come potenziali subunità e come adiuvanti naturali<…

Materials

A2 type Biosafety Cabinet	Thermo Fisher Scientific, USA		1300 series
Bench top Centrifuge	Eppendorf, USA		5810 R
BstB1, HindIII, HpaI	NEB, USA		NEB
Cell densitometer	GE Healthcare, USA		Ultraspec 10
Citric Acid	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Dibasic Potassium Phosphate	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Double Distilled Water	Merck, USA		~18.2 MW/cm @ 25 oC
Electroporation cuvettes	Bio-Rad, USA		2 mm
Electroporator	Bio-Rad, USA		Electroporator
EsxA-specific Ab	Abcam, UK		Rabbit polyclonal
Ferric Ammonium Citrate	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Floor model centrifuge	Thermo Fisher Scientific, USA		Sorvall RC6 plus
Glassware	Borosil, INDIA		1 L Erlenmeyer flasks
Glycerol	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
HEPES and Sodium Chloride	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Incubator shakers	Thermo Fisher Scientific, USA		MaxQ 6000 & 8000
L-Asparagine	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Luria Bertani Broth and Agar, Miller	Hi Media, INDIA		Hi Media
Magnesium Sulfate Heptahydrate	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Magnetic stirrer	Tarsons, INDIA		Tarsons
mCherry-specific Ab	Abcam, UK		Rabbit monoclonal
Microwave	LG, INDIA		MC3286BLT
Middlebrook 7H9 Broth	BD, USA		Difco Middlebrook 7H9 Broth
Middlebrook ADC enrichment	BD, USA		BBL Middlebrook ADC enrichment
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific, USA		Spectronic 200 UV-Vis
NEB5a	NEB, USA		a derivative of DH5a
Optiprep (Iodixanol)	Merck, USA		Available as 60% stock solution (in water)
PCR purification kit	Hi Media, INDIA		Hi Media
pH Meter	Mettler Toledo, USA		Mettler Toledo
Plasmid DNA mini kit	Hi Media, INDIA		Hi Media
Plate incubator	Thermo Fisher Scientific, USA		New Series
Plasmid pMV261	Addgene, USA * *The   plasmid   is   no   more available in this plasmid bank		Shuttle vector
Proof-reading DNA Polymerase	Thermo Fisher Scientific, USA		Phusion DNA Plus Polymerase
Q5 Proof-reading DNA Polymerase	NEB, USA		NEB
Refrigerated circulating water bath	Thermo Fisher Scientific, USA		R20
Middlebrock 7H11 Agar base	BD, USA		BBL Seven H11 Agar base
SOC broth	Hi Media, INDIA		Hi Media
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
T4 DNA Ligase	NEB, USA		NEB
Tween-80	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Ultracentrifuge	Beckman Coulter, USA		Optima L100K
Ultracentrifuge tubes – 14 mL	Beckman Coulter, USA		Polyallomer type – ultra clear type in SW40Ti rotor
Ultracentrifuge tubes – 38 mL	Beckman Coulter, USA		Polypropylene type– cloudy type for SW28 rotor
Ultrasonics cleaning waterbath sonicator	Thermo Fisher Scientific, USA		Sonicator – bench top model
0.22 µm Disposable filters	Thermo Fisher Scientific, USA		Nunc-Nalgene
30-kDa Centricon concentrators	Merck, USA		Amicon Ultra centrifugal filters – Millipore
3X FLAG antibody	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
400 mL Centrifuge bottles	Thermo Fisher Scientific, USA		Nunc-Nalgene
50 mL Centrifuge tubes	Corning, USA		Sterile, pre-packed
Bacteria
Strain
Escherichia coli	NEB, USA		NEB 5-alpha (a derivative of DH5α).
Msm expressing cfp29::mCherry	This study		MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA	This study		MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG	This study		MC2 155
Mycobacterium smegmatis (Msm)	Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA		MC2 155