Summary
在这里，我们描述了用于观察拟南芥花粉管引导和接收的半体外（SIV）方法的改进，该方法增加了胚珠的接受性。高通量SIV暨隔膜法可以与配子体标记系和遗传编码生物传感器相结合，以监测受精的动态过程。
Abstract
在开花植物中，雌蕊内花粉管（雄配子体）的生长和引导以及雌配子体对花粉管的接收对于双重受精和随后的种子发育至关重要。在花粉管接收过程中，雄性和雌配子体之间的相互作用最终导致花粉管破裂和两个精子细胞的释放以实现双重受精。由于花粉管生长和双重受精深深地隐藏在花的组织中，这个过程在 体内很难观察到。
在几项研究中，已经开发并实施了用于模式植物拟南芥受精活细胞成像的半体外（SIV）方法。这些研究有助于阐明开花植物受精过程的基本特征，以及在雄性和雌配子体相互作用期间发生哪些细胞和分子变化。然而，由于这些活细胞成像实验涉及单个胚珠的切除，因此每次成像会话的观察次数很少，这使得这种方法既乏味又非常耗时。除其他技术困难外，经常报告花粉管未能在体外使胚珠受精，这严重混淆了这种分析。
在这里，提供了一个详细的视频协议，用于以自动化和高通量的方式对花粉管接收和受精进行成像，允许每次成像会话最多观察40次花粉管接收和破裂。结合使用基因编码的生物传感器和标记线，该方法能够以更少的时间投资生成大样本量。该技术的细微差别和关键点，包括花分期、解剖、培养基制备和成像，都以视频格式清晰详细，以促进未来对花粉管引导、接收和双重受精动力学的研究。
Introduction
有性繁殖生物中遗传上独特的后代的产生取决于雄性和雌性配子的成功融合。在开花植物中，两个雄配子（精子细胞）与两个雌配子（卵细胞和中央细胞）在双重受精过程中的相互作用取决于花粉管（雄配子体）释放的精子。这个过程称为花粉管接收，主要由驻留在胚胎囊（雌配子体）内的协同细胞控制1，2。由于花粉管接收发生在花的深处，因此已经建立了一种允许对该过程进行活细胞成像的方法，称为半体外（SIV）花粉管接收3。使用这种方法，将切除的拟南芥胚珠放置在半液体花粉萌发培养基上，并通过花粉管靶向，花粉管通过样式传递道连接处切断的雌蕊的柱头和样式生长3，4。自从这项技术发展以来，详细的观察导致了围绕花粉管引导、接收和受精的几个发现。其中，这些发现包括通过柱头生长获得花粉管靶向能力3，花粉管到达时协同细胞内钙振荡的开始5，6，7，8，9，以及花粉管破裂时精子细胞释放和受精的动力学10.然而，由于这种技术依赖于胚珠的切除，受精的观察数量有限，花粉管接收往往异常，导致花粉管破裂失败（视频1和补充文件1）。因此，需要一种更有效的方法，以便对花粉管接收和受精进行高通量分析。
在制定该协议时，测试了几种分析花粉管接收的新方法，从最“体外”到最“体内”的方法，并确定了基于整个隔膜切除的有效技术，该技术允许每天多达40次受精观察。在这里，概述了该技术的细微差别和关键点，包括花分期、解剖、培养基制备和成像设置。通过遵循该协议，应促进以花粉管引导，花粉管接收和双重受精为重点的研究。该方法允许的样本量越大，预计将增强从实时成像实验中得出的结论的科学合理性。该技术的潜在应用包括但不限于通过使用遗传编码的生物传感器观察配子体相互作用期间胞质钙浓度（[Ca2+]cyt），pH或H 2 O2的分子和生理变化。此外，使用这种改进的方法可以更容易地观察到细胞学变化，例如感受协同作用的退化，精子细胞迁移或核瑜伽。最后，可以在宽场显微镜下监测不同施肥阶段的时间，然后可以使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）或双光子激发显微镜（2PEM）进行更详细的分析，以获得更高的分辨率和3D重建。
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Protocol
注意：有关此协议中使用的材料和设备的列表，请参阅 材料表 。
1. 设计成像实验的注意事项
- 预先确定捕获要观察的所需现象所需的成像持续时间和采样频率。例如，根据奈奎斯特采样定理，采样频率必须大于输入样本最高频率的两倍。因此，为了准确捕获协同[Ca 2+]cyt 振荡，大约每10秒进行一次成像，但要测量花粉管排出时精子细胞的速度，请确保时间分辨率小于1 s10。
- 为感兴趣的细胞选择荧光标记物，这些标记物在背景自发荧光之外足够明亮。对于生物传感器的使用，选择不会干扰细胞功能的最亮线，因为它们通常更灵敏并且需要更少的曝光时间。
- 考虑哪种类型的荧光显微镜和放大倍率最适合捕获所需现象。使用宽视场显微镜和低放大倍率物镜从更大的景深捕获光线，并随着时间的推移保持焦点，对较大的物体（如整个胚珠）进行成像，或使用对色移伪影敏感的比率传感器。使用CLSM或2PEM与高放大倍率物镜，以获得更好的细胞和亚细胞物体分辨率，但请注意随着时间的推移难以保持焦点。
- 估计每个实验要成像的样本数量。例如，由于自动对焦和多级采集功能需要时间，使用最短采样时间为~30秒的10倍物镜对三个隔膜成像，每个实验最多成像40个受精事件。
2.花粉萌发培养基制备
- 使用储存在-20°C的每种微量营养素的1M等分试样储备制备液体花粉萌发培养基（5mM CaCl2，1mM MgSO4，5mM KCl，0.01%[w / v] H 3 BO3和10%[w / v]蔗糖）。 用0.1M KOH将pH值调节至7.5。将培养基在4°C下储存长达2周。
注意：pH值可能会随着时间的推移而下降。 - 将 2.5 mL 液体培养基加入 10 mL 烧杯中，并用快速旋转的搅拌棒缓慢加入 32 mg 超低熔点琼脂糖 （~1.3%），以避免结块。
- 在65°C的加热板上融化琼脂糖，并章动烧杯以收集侧面的任何冷凝水。
- 将 130 μL 培养基移液到 35 mm 玻璃底培养皿的 14 mm 孔中，并旋转培养皿直到培养基覆盖孔。
- 用移液器从培养皿中心吸出总共 40 μL，留下 90 μL 的总体积。
注意：可以从孔中吸出更多的培养基，以实现较低的总体积;这对于具有低工作距离的高放大倍率物镜可能是必要的。然而，琼脂垫越薄，它变干的速度就越快。 - 在湿度室的铝块上冷却培养皿，以确保均匀冷却。将板在4°C下储存过夜，以便第二天早上使用。
3. 隔膜供体、柱头供体和花粉供体的花期
图1：隔膜供体、柱头供体和花粉供体的花期。 （A）花序内拟南芥花（Ler-0）的阶段。12B阶段的花蕾，花瓣即将开放，花药黄色，应通过去除所有萼片，花瓣和雄蕊来阉割。雌蕊（拥有雌配子体制造商）可在24小时后用作隔膜供体。（B）花序内拟南芥花（Col-0）的阶段。12B阶段的花蕾具有黄色的不裂开的花药和柱头，勉强从花瓣中冒出，应通过去除所有萼片，花瓣和雄蕊来阉割。然后，雌蕊可在24小时后用作柱头供体，此时它们应由开放并脱落花粉的花朵（含有雄配子体标记）授粉。授粉柱头应在授粉后1小时内解剖。请点击此处查看此图的大图。
- 成像前的早晨，选择 拟南芥 植物作为隔膜供体和柱头供体;确保它们健康并且最近开始产生长方形。
注意：兰茨贝格 直立 （Ler-0）是用作隔膜供体的良好加入物，因为它的隔膜坚固，胚珠之间有小节间。哥伦比亚（Col-0）是一个很好的加入，可用作柱头供体，因为它们似乎有利于花粉管的生长。 - 通过去除雄蕊、萼片和花瓣，阉割至少三朵 12B 期隔膜供体花和 12 期柱头供体花（图 1A、B）。在同一花序上也去除较老的花朵，这可能会为被阉割的花授粉。
- 早上，24小时后，用容易脱落花粉的花粉供体花（例如，携带花粉管或精子细胞标记）为柱头供体授粉。当柱头几乎完全被花粉覆盖时，授粉完成（图1B）。
4.鼻中隔夹层
图 2：鼻中隔和柱头解剖快速指南 。 （A）隔膜夹层的步骤。用胰岛素注射器针将雌蕊固定在双面胶带上，并在样式-卵巢连接处和卵巢-椎弓根连接处进行切割，然后沿着任一心皮的隔膜进行浅切口（步骤1）。将心皮壁剥离回胶带上（步骤2）。在顶部隔膜下切开梅花（步骤3）。切开样式处的隔膜，然后使用蒂处的镊子取出（步骤4）。将隔膜放在琼脂培养基上，并用镊子轻轻嵌入。（B）污名解剖的步骤。将雌蕊（授粉<前1小时）固定在双面胶带上，并用剃须刀片在样式 - 卵巢连接处切割（步骤6）。将柱头放在琼脂培养基上，在隔膜旁边用胰岛素针，并将距离调整至约250μm（步骤7-8）。确保在样式的微孔和底部周围形成半液体池（步骤9）。 请点击此处查看此图的大图。
- 授粉后30分钟，在椎弓根处收集健康成熟的隔膜供体雌蕊，并将它们放在安装在载玻片上的新鲜双面粘性胶带上，柱头刚好粘在胶带边缘。
注意：限制雌蕊在胶带上的解剖时间，以确保尽可能短。解剖应在高湿度下进行，这可以通过在载玻片旁边放置加湿器来实现。 - 使用新的胰岛素注射器针头的背面轻轻按压椎弓根和沿卵巢，将雌蕊牢固地固定在胶带上，然后去除阉割留下的萼片、花瓣和雄蕊碎片。
- 在立体镜下，使用胰岛素注射器针头在样式 - 卵巢连接处和卵巢 - 蒂连接处的每个心皮进行两次切口，然后沿着每个心皮的隔膜进行浅切口（图2，步骤1）。
注意：沿鼻中隔切得太深会切断索道处的胚珠。 - 小心地将卵巢壁剥离到胶带上（图2，步骤2），然后将针头在两个隔膜之间轻轻滑动，以沿雌蕊的整个长度切割replum，而不会干扰胚珠（图2，步骤3）。
注意：从样式到蒂的方向切开梅花，以确保顶部隔膜上的胚珠尽可能少地受到干扰。 - 在与样式和蒂的连接处轻轻切割顶部隔膜，然后用镊子从椎弓根侧取出隔膜（图2，步骤4）。
注意：保持这种切口笔直而轻柔，以使隔膜保持平坦且不会弯曲。 - 将隔膜尽可能平坦地放在培养基上，使胚珠的微粒面朝上并在同一焦平面上。将隔膜轻轻按入培养基中，直到胚珠略微嵌入培养基中（图2，步骤5）。
注意：至关重要的是，隔膜的放置使胚珠的小胚珠可以进入花粉管（任何无法接近的胚珠都可以用针轻轻地重新排列）。包埋后，隔膜周围应形成一小滩液体。 - 重复步骤4.1-4.6，最多再放置两个雌蕊，将隔垫首尾相连。
5. 柱头解剖
- 将授粉的柱头供体雌蕊放在安装在载玻片上的新鲜双面粘性胶带上，使得卵巢式连接脱离胶带边缘（图2，步骤6）。
- 使用新鲜的剃须刀片将样式直接向下切割并抬起以保持柱头附着在刀片上（图 2，步骤 6）。
注意：在胶带边缘切割以获得最干净的切割。 - 用胰岛素注射器针头从刀片上去除柱头，并将其平放至距胚珠约250-300μm（图2，步骤7-8）。
注意：样式应水平朝向侧面;否则，大部分花粉管将在隔膜下生长。在样式入口处应出现一小池液体，将其放置在培养基上1分钟后;这是一个好兆头，因为花粉管会顺利退出样式。 - 重复步骤5.1-5.3，最多12个柱头，在每个隔膜的两侧放置两个柱头。寻找胚珠微胚珠周围形成的一小池液体;这有助于花粉管对胚胎囊的可及性和靶向性（图2，步骤9）。
注意：限制培养皿打开的时间，以防止培养基和胚珠变干。
6. 成像
图 3：SIV 暨隔膜成像方案。 （A） 完整的 SIV 暨隔膜设置，具有 12 个授粉柱头和 3 个隔膜，通过立体镜观察。（B）使用10倍物镜孵育后5小时内看到的完整SIV暨隔膜设置的合并图像，五个概述区域（每个~1 mm）标记为多级采集。绿色框显示了接受花粉管的胚珠在协同作用中经历爆炸性爆发。（C）在不同时间点近距离观察概览区域2。在显微镜上的湿度室中孵育约3小时后，花粉管应到达小皮附近，并且通过成像6小时，大多数胚珠应正确接收花粉管（绿色方块）;然后这些胚珠经历爆炸性花粉管爆裂（星号）。比例尺 = （A） 5 毫米，（B，C） 500 μm。 请点击此处查看此图的大图。
- 解剖完成后，培养皿准备好成像，使其在显微镜上的湿度室中孵育，保持92%相对湿度和21°C。
注意：如果没有湿度室可用于显微镜，则在盖子和培养皿的外边缘衬上少量水将有助于保持培养皿中的高湿度。 - 在低光强度的明场下聚焦样品，然后切换到荧光灯，在要成像的载物台概览上标记样品的区域。
注意：在10倍放大倍率下，可以标记大约五个区域，总共三个隔膜（图3）。限制用于标记概览区域的时间量，以尽量减少光毒性或荧光灯对样品的加热。 - 使用多级采集方案开始成像，在每个概览区域的开头具有自动对焦功能。由于花粉管将在孵育样品后~1小时从样式中出来，因此将采集延迟2小时或直到花粉管到达小筛。确保自动对焦设置为100 μm范围（7 μm大步长和1 μm精细步长），以保持胚珠对焦，因为隔膜会随着时间的推移而轻微移动和下沉。
- 开始样品孵育后~9小时停止图像采集，因为此时大多数胚珠应该已经吸引并接受了花粉管。
注意：如果少量胚珠吸引花粉管，在立体镜下仔细观察培养皿有助于确定下次如何改善胚珠或样式方向。
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Representative Results
为了评估拟 南芥 中受性协同细胞核变性相对于花粉管破裂的时间，以及观察左协同作用或右协同作用是否注定要成为受体协同增效物，采用此处描述的SIV 暨隔膜 方法，使用雌配子体核标志物与协同胞质标志物（pFG：roGFP2-ORP1-NLS，pMYB98：roGFP2-ORP1）作为隔膜供体，雄配子体标记（pLAT52：R-GECO）作为花粉供体。根据协议的第4-5节，在阉割后24小时解剖隔膜和授粉柱头，并用前一天准备的培养基将其放置在玻璃底培养皿上。将每个培养皿放置在显微镜上的湿度室中，并使用具有五个概览区域的10倍物镜（数值孔径：0.4）进行多级实验（图3）。每个区域的图像每60秒拍摄一次，持续9小时，具有四个荧光通道：R-GECO的通道（1）560/640（25毫秒），roGFP2-ORP1的通道（2）488/520（60毫秒），roGFP2-ORP1（60毫秒）的通道（3）387/520和背景减去的通道（4）387/640（60毫秒）（表1）。在图像采集前，每分钟使用100 μm范围，7 μm粗步进和1 μm精细步进的自动对焦功能。在斐济打开五个图像文件，分离通道，然后将图像手动平铺在一起（视频2 和 补充文件1）。
在视频2（另见补充文件1）中，在胚珠内可以看到41个爆炸性花粉管破裂的例子，绿色方块标记了感兴趣的区域。使用钙生物传感器线pLAT52：RGECO作为花粉供体，在它们裂解的花粉管尖端观察到爆炸性花粉管破裂的情况。值得注意的是，由于生物传感器突然暴露于高水平的钙中，其亮度迅速增加。爆炸性花粉管破裂也可以用基于GFP或基于RFP的精子细胞或胞质标记物进行分析，这些标记物也显示精子或细胞质含量的快速释放。花粉管破裂后，观察到感受协同的细胞核同时降解（在实验中的1分钟时间分辨率内），并且在花粉管破裂时也观察到卵细胞核向微细胞的迁移由于核瑜伽术（视频3和补充文件1）。左和右协同都能够作为感受协同，并且观察到两次花粉管爆发的实例，首先在感受协同中，其次在持续协同中。视频 2（另见补充文件 1）显示了 10 个花粉管接收缺陷的示例，可以在胚珠中看到，感兴趣的区域用红色方块标记。因此，相对于吸引花粉管的胚珠，花粉管接收的总体效率为~80%。在这些不成功的情况下，花粉管要么阻止它们在小堆中的生长，要么在快速生长到协同细胞后阻止它们的生长，要么无法阻止它们的生长并继续在胚胎囊内生长和盘绕。没有任何指示感兴趣区域的胚珠未能吸引花粉管或未处于可接近的方向。在视频3（另见补充文件1）中可以看到阴性和阳性结果的放大示例，显示了两个花粉管接收缺陷的实例（视频3A，C和补充文件1），以及两个成功接收花粉管的实例（视频3B，D和补充文件1）。
图 4：SIV 方法效率比较。SIV切除胚珠方法的八次技术重复（总共71个胚珠）显示只有~28%的胚珠具有爆炸性花粉管爆发，导致效率范围为~10%-50%。SIV 暨隔膜法的 5 次技术重复（8 个隔膜和 102 个胚珠）显示 ~79% 的胚珠伴爆炸性花粉管爆裂，效率范围为 ~70%-100%。仅计算将花粉管吸引到小胚珠的胚珠和具有足够记录时间接收吸引花粉管的胚珠。“X”分别表示平均值，中心线表示中位数（第 50个百分位数）。上四分位数和下四分位数之外的线显示了成功接收花粉管的最小和最大百分比。基于非配对t检验的两种方法之间，花粉管破裂的胚珠百分比差异显著（p < 0.001）。缩写：SIV = 半体外。请点击此处查看此图的大图。
| 设备/设置 | 补充视频2和3 |
| 显微镜 | 奥林巴斯IX-81F-ZDC2倒置显微镜 |
| 温度控制 | Life Imaging Services GmbH Cube & Box （22C） |
| 湿度控制 | 生命成像服务有限公司砖（92%相对湿度） |
| 软件 | 奥林巴斯细胞尺寸 2.3 |
| 实时控制器 | 奥林巴斯U-RTC |
| 激光 | MT20- 150 W 氙弧燃烧器 |
| 物镜 | 10x 空气浸入式 U Plan SApo 物镜 （0.4 NA），工作距离 3.1 mm |
| 镜子立方体 | GFP/RFP |
| 滤光轮 | 奥林巴斯U-FFWO |
| 通道 1 （25 ms） ： 反射 （560/25） 观测 （624/40） | |
| 通道 2 （60 ms）：反射 （485/20） 观察 （525/30） | |
| 通道 3 （60 ms）：反射 （387/11） 观察 （525/30） | |
| 通道 4 （60 ms）： 反射 （387/11） 观测 （624/30） | |
| 探测器 | 滨松逆戟鲸融合数码CMOS相机 |
| 自动对焦 | 100 μm 量程，7 μm 粗步，1 μm 精细步长 |
| 时间间隔 | 1 分钟 |
表1：本手稿中使用的显微镜系统和设置。
视频1：SIV切除胚珠方法的延时摄影。 使用切除的胚珠对SIV的八个技术重复进行合并延时摄影，显示花粉管（携带 pLAT52：R-GECO）的生长和胚珠内的花粉管接收。20个绿色框显示了协同作用中爆炸性花粉管爆裂的实例，51个红色框显示了花粉管爆裂和过度生长的实例。延时在 260 分钟到 400 分钟之间，比例尺为 100 μm。 请点击这里下载此视频。
视频 2：SIV 暨隔膜 延时摄影。 （A）仅使用RFP通道（通道1）合并胚珠内花粉管生长和接收的所有五个概述区域（见 图3）的延时摄影。花粉含有 pLAT52：R-GECO 和胚珠 pFG：roGFP2-ORP1-NLS; pMYB98：roGFP2-ORP1. 41个绿色框显示爆炸性花粉管爆裂的实例，10个红色框显示花粉管爆裂失败和花粉管过度生长的实例。（B）与RFP和GFP通道（通道1和通道2）的相同延时，显示花粉管接收期间配子和协同细胞中的核动力学。右上角的数字表示时间（h：min）。比例尺 = 500 μm。 请点击这里下载此视频。
视频 3：SIV 暨隔膜阳性和阴性结果示例。 （A，C）从 视频2 中取出的胚珠示例显示了两个受精失败的实例。在 A中，花粉管无法阻止生长并继续在胚胎囊中盘绕。在 C中，可以看到第二类花粉管过度生长，其中第一根花粉管在生长成协同管时经历快速生长，但阻止生长而不会破裂。（乙，四）从 视频 2 中获取的示例胚珠显示了成功接收花粉管的两个实例。野生型花粉管爆发表明花粉管在协同体中爆发破裂，卵细胞核向小筛的迁移表明核生。右上角的数字表示时间（h：min）。箭头表示感受合细胞核（rSN），箭头表示花粉管破裂（裂解）后卵细胞核（EN）的迁移。比例尺 = 30 μm。 请点击此处下载此视频。
补充文件 1：视频 1、视频 2 和视频 3 的静止图像。请点击此处下载此文件。
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Discussion
这份手稿介绍了拟 南芥花粉管接收和双重受精成像的有效方案。改进的方法SIV 暨隔膜大大提高了每个成像会话可观察到的成功花粉管接收事件的百分比和总数。此处显示的代表性结果展示了一个成像会话，其中有41个成功的花粉管接收事件和10个显示接收缺陷的胚珠（~80%效率）。这是使用原始 SIV 切除胚珠方法在总共 8 次成像会话中捕获的成功花粉管接收事件数量的两倍多（视频 1）。在五个技术重复中使用SIV 暨隔膜 方法，总共八个隔膜，我们实现了79%的平均花粉管接收效率，而使用SIV切除隔膜方法和八个技术重复的平均效率为28%（图4）。
虽然SIV 暨隔膜 法的花粉管接收效率要高得多，但花粉管过度生长的情况仍然以不同的速率发生，这取决于几个因素。最重要的是，协同细胞必须在成像的几个小时内保持活力和接受。在解剖和成像过程中保持潮湿的环境，使用新鲜的培养基，将胚珠和隔膜嵌入半液体琼脂中，以及避免在图像采集过程中过度暴露产生的热量都是确保成功接收花粉管的关键因素。花粉管对胚珠微胚珠的可及性和吸引力也是限制成功接收花粉管事件数量的关键因素。尽量减少解剖过程中胚珠对隔膜的干扰，使隔膜朝上，并在胚珠和样式的开口之间形成半液体池是花粉管吸引的关键。该池的形成可能因低熔点琼脂品牌而异，因此，建议用1%至1.5%的不同百分比的琼脂开始实验。最后，解剖的难度意味着它需要一些练习，建议保持耐心，在解剖前练习放松和深呼吸，重要的是，注意提高稳定性和一致性的技术（例如，手定位，滑动方向）。
SIV 暨隔膜 法的这种详细协议应大大提高旨在对花粉管接收和双重受精进行实时成像的实验的效率和样品数量。应用包括使用基因编码的生物传感器、突变体分析以及双重受精之前、期间和之后细胞学事件的描述性观察。我们希望这种方法可以扩展并扩展到其他开花植物物种，在这些植物物种中，在卵巢胎盘上维持胚珠可能是有益的。
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Disclosures
作者报告没有利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢Sara Simonini和Stefano Bencivenga捐赠 pFG：roGFP2-ORP1-NLS 构建体，感谢Christof Eichenberger，Johann Almendinger，Vincent Sutter和Celia Baroux对显微镜的建议。我们衷心感谢拉维·帕拉尼维卢、菲利普·丹宁格、莎朗·凯斯勒、马克·约翰逊、川岛智和以及 2022 年有性植物繁殖国际会议上对 SIV 暨隔 膜协议表现出兴趣的其他人的建议。这项工作得到了苏黎世大学的支持和瑞士国家科学基金会对U.G的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm glass slide | Epredia | 16211551 | |
| 35 mm glass bottom dish (14 mm well) | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Calcium Chloride | Roth | CN93.1 | |
| Columbia (Col-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | stigma donor | |
| Dissecting Scope | Olympus | SZX2-ILLT | |
| Insulin needle (0.3 G) | BD | 304000 | |
| Landsberg erecta (Ler-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | septum donor | |
| Magnesium Sulfate | Merck | 5886 | |
| Potassium Chloride | Roth | 6781.1 | |
| Razor blade | Beldura | 7026797 | |
| Scotch double sided tape | Scotch | 768720 | Less thick and good for stigma dissection |
| Sodium Chloride | Roth | 3957.1 | |
| Sucrose | ITW reagents | A2211,1000 | |
| Tesa double sided tape | Tesa | 05681-00018 | Very sticky and good for septum dissection |
| Ultra low gelling temperature agarose | FMC SeaPrep | 50302 |
References
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