Microiniezione mirata ed elettroporazione di organoidi cerebrali di primati per la modificazione genetica
Summary
L’elettroporazione degli organoidi cerebrali dei primati fornisce un approccio preciso ed efficiente per introdurre modificazioni genetiche transitorie in diversi tipi di progenitori e neuroni in un sistema modello vicino allo sviluppo della neocorteccia (pato)fisiologica dei primati. Ciò consente lo studio dei processi neuroevolutivi e di sviluppo e può essere applicato anche per la modellizzazione delle malattie.
Abstract
La corteccia cerebrale è la struttura cerebrale più esterna ed è responsabile dell’elaborazione degli input sensoriali e dell’output motorio; È visto come la sede delle abilità cognitive di ordine superiore nei mammiferi, in particolare nei primati. Lo studio delle funzioni geniche nel cervello dei primati è impegnativo per ragioni tecniche ed etiche, ma l’istituzione della tecnologia degli organoidi cerebrali ha permesso lo studio dello sviluppo del cervello in modelli tradizionali di primati (ad esempio, macaco rhesus e uistitì comune), nonché in specie di primati precedentemente inaccessibili sperimentalmente (ad esempio, grandi scimmie), in un sistema eticamente giustificabile e meno tecnicamente impegnativo. Inoltre, gli organoidi cerebrali umani consentono l’indagine avanzata dei disturbi neurologici e dello sviluppo neurologico.
Poiché gli organoidi cerebrali ricapitolano molti processi di sviluppo del cervello, rappresentano anche un potente strumento per identificare le differenze e confrontare funzionalmente i determinanti genetici alla base dello sviluppo cerebrale di varie specie in un contesto evolutivo. Un grande vantaggio dell’utilizzo di organoidi è la possibilità di introdurre modificazioni genetiche, che consentono di testare le funzioni geniche. Tuttavia, l’introduzione di tali modifiche è laboriosa e costosa. Questo articolo descrive un approccio rapido ed economico per modificare geneticamente le popolazioni cellulari all’interno delle strutture simili a ventricole degli organoidi cerebrali dei primati, un sottotipo di organoidi cerebrali. Questo metodo combina un protocollo modificato per la generazione affidabile di organoidi cerebrali da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) umane, scimpanzé, macaco rhesus e comuni derivate da uistitì con un approccio di microiniezione ed elettroporazione. Ciò fornisce uno strumento efficace per lo studio dei processi neuroevolutivi e di sviluppo che può essere applicato anche per la modellizzazione delle malattie.
Introduction
Studiare lo sviluppo (pato)fisiologico e l’evoluzione della corteccia cerebrale è un compito formidabile che è ostacolato dalla mancanza di sistemi modello adeguati. In precedenza, tali studi erano limitati a modelli di coltura cellulare bidimensionale (come il progenitore neurale primario o le colture cellulari neuronali) e modelli animali evolutivamente distanti (come i roditori)1,2. Mentre questi modelli sono utili per affrontare alcune domande, sono limitati nel modellare la complessità, la composizione del tipo di cellula, l’architettura cellulare e i modelli di espressione genica della neocorteccia umana in via di sviluppo in stati sani e malati. Queste limitazioni portano, ad esempio, alla scarsa traducibilità dei modelli murini di malattie umane alla situazione umana, come descritto per alcuni casi di microcefalia (ad esempio, Zhang et al.3). Recentemente, i primati transgenici non umani, che sono un modello evolutivamente, funzionalmente e morfologicamente più vicino dello sviluppo della neocorteccia umana, sono stati messi a fuoco 4,5,6,7,8 in quanto superano molti limiti dei modelli basati su colture cellulari e roditori. Tuttavia, l’uso di primati non umani nella ricerca non è solo molto costoso e richiede tempo, ma solleva anche preoccupazioni etiche. Più recentemente, lo sviluppo della tecnologia degli organoidi cerebrali 9,10 è emerso come un’alternativa promettente che risolve molti dei limiti dei precedenti modelli 11,12,13,14,15,16.
Gli organoidi cerebrali sono strutture multicellulari tridimensionali (3D) che emulano le caratteristiche principali della citoarchitettura e della composizione di tipo cellulare di una o più regioni cerebrali per una finestra temporale di sviluppo definita 11,12,13,14,17. Queste strutture 3D sono generate da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) o, se disponibili per le specie di interesse, da cellule staminali embrionali (ESC). In generale, due tipi di organoidi cerebrali possono essere distinti in base alla metodologia utilizzata: organoidi cerebrali non guidati e regionalizzati (guidati)18. Nel generare quest’ultimo tipo di organoidi, vengono fornite piccole molecole o fattori che guidano la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti in organoidi di una particolare regione del cervello (ad esempio, organoidi del proencefalo)18. Al contrario, negli organoidi non guidati, la differenziazione non è guidata dall’aggiunta di piccole molecole, ma piuttosto si basa esclusivamente sulla differenziazione spontanea delle iPSCs/ESC. Gli organoidi cerebrali risultanti sono costituiti da tipi di cellule che rappresentano diverse regioni del cervello (ad esempio, organoidi cerebrali)18. Gli organoidi cerebrali combinano molte caratteristiche chiave dello sviluppo cerebrale con una generazione relativamente efficiente in termini di costi e tempi da qualsiasi specie di interesse per la quale sono disponibili iPSC o ESC 11,12,13,14. Ciò rende gli organoidi cerebrali un modello eccellente per molti tipi di studi neurobiologici, che vanno dalle domande evolutive e di sviluppo alla modellizzazione delle malattie e ai test farmacologici15,16. Tuttavia, affrontare tali domande utilizzando organoidi cerebrali dipende fortemente dalla disponibilità di diversi metodi per la modificazione genetica.
Un aspetto chiave dello studio dello sviluppo (pato)fisiologico della neocorteccia e della sua evoluzione è l’analisi funzionale dei geni e delle varianti geniche. Questo di solito è ottenuto dall’espressione (ectopica) e / o dal knock-down (KD) o knock-out (KO) di quei geni. Tali modificazioni genetiche possono essere classificate in modificazioni genetiche stabili e transitorie, nonché in modificazioni limitate o non limitate nel tempo e nello spazio. La modificazione genetica stabile è definita dall’introduzione di un’alterazione genetica nel genoma ospite che viene trasmessa a tutte le generazioni cellulari successive. A seconda del punto temporale della modificazione genetica, può interessare tutte le cellule di un organoide o può essere limitato a determinate popolazioni cellulari. Più frequentemente, la modificazione genetica stabile viene raggiunta negli organoidi cerebrali a livello iPSC / ESC applicando lentivirus, sistemi simili ai trasposoni e la tecnologia CRISPR / Cas9 (riveduta da, ad esempio, Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 e Teriyapirom et al.20). Ciò ha il vantaggio che tutte le cellule dell’organoide cerebrale portano la modificazione genetica e che non è limitata temporalmente o spazialmente. Tuttavia, la generazione e la caratterizzazione di queste linee stabili iPSC/ESC richiedono molto tempo, spesso impiegando diversi mesi prima che i primi organoidi cerebrali modificati possano essere analizzati (esaminati ad esempio, da Fischer et al.17, Kyrousi et al.19, o Teriyapirom et al.20).
Al contrario, la modificazione genetica transitoria è definita dalla consegna di carico genetico (ad esempio, un plasmide di espressione genica) che non si integra nel genoma dell’ospite. Mentre questa modifica può, in linea di principio, essere trasmessa alle generazioni cellulari successive, il carico genetico consegnato sarà progressivamente diluito con ogni divisione cellulare. Pertanto, questo tipo di modificazione genetica è solitamente limitato temporalmente e spazialmente. La modificazione genetica transitoria può essere effettuata negli organoidi cerebrali da virus adeno-associati o mediante elettroporazione (esaminata da, ad esempio, Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 e Teriyapirom et al.20), con quest’ultimo descritto in dettaglio in questo articolo. A differenza della modificazione genetica stabile, questo approccio è molto rapido ed economico. Infatti, l’elettroporazione può essere eseguita in pochi minuti e, a seconda della popolazione di cellule bersaglio, gli organoidi elettroporati sono pronti per l’analisi in pochi giorni (esaminati da, ad esempio, Fischer et al.17 e Kyrousi et al.19). Tuttavia, i cambiamenti morfologici grossolani dell’organoide cerebrale, come le differenze di dimensioni, non possono essere rilevati utilizzando questo metodo, poiché questo tipo di modificazione genetica è limitato temporalmente e spazialmente. Questa restrizione può anche essere un vantaggio, ad esempio, nel caso di studiare singole popolazioni cellulari all’interno dell’organoide o gli effetti sugli organoidi cerebrali in specifici punti temporali dello sviluppo (rivisti da, ad esempio, Fischer et al.17 e Kyrousi et al.19).
Un approccio classico per studiare la funzione genica durante lo sviluppo e l’evoluzione del cervello è l’elettroporazione in utero. L’elettroporazione in utero è una tecnica ben nota e utile per la veicolazione di costrutti di espressione genica nel cervello dei roditori 21,22,23 e del furetto 24,25. In primo luogo, una soluzione contenente il costrutto o i costrutti di espressione di interesse viene microiniettata attraverso la parete uterina in un certo ventricolo del cervello embrionale, a seconda della regione da prendere di mira. Nella seconda fase, vengono applicati impulsi elettrici per trasfettare le cellule che rivestono direttamente il ventricolo mirato. Questo approccio non è limitato solo all’espressione ectopica o alla sovraespressione di geni, in quanto può essere applicato anche in studi KD o KO microiniettando forcine corte (shRNA) o CRISPR / Cas9 (sotto forma di plasmidi di espressione o ribonucleoproteine [RNP]), rispettivamente26,27. Tuttavia, l’elettroporazione in utero di embrioni di topo, ratto e furetto ha le stesse limitazioni descritte sopra per questi modelli animali.
Idealmente, si vorrebbe eseguire l’elettroporazione in utero direttamente nei primati. Mentre questo è, in linea di principio, tecnicamente possibile, l’elettroporazione in utero non viene condotta nei primati a causa di preoccupazioni etiche, alti costi di manutenzione degli animali e piccole dimensioni della cucciolata. Per alcuni primati, come le grandi scimmie (compresi gli umani), questo non è affatto possibile. Tuttavia, questi primati hanno il più grande potenziale per lo studio dello sviluppo della neocorteccia umana (pato)fisiologica e della sua evoluzione. Una soluzione a questo dilemma è applicare la tecnica dell’elettroporazione agli organoidi cerebrali dei primati28.
Questo articolo presenta un protocollo per l’elettroporazione di un sottotipo di organoidi cerebrali di primati, organoidi cerebrali di primati. Questo approccio consente la modificazione genetica rapida ed economica delle popolazioni cellulari all’interno delle strutture simili a ventricole degli organoidi. In particolare, descriviamo un protocollo unificato per la generazione di organoidi cerebrali di primati da iPSC umane (Homo sapiens), scimpanzé (Pan troglodytes), macaco rhesus (Macaca mulatta) e uistitì comune (Callithrix jacchus). Inoltre, descriviamo in dettaglio la tecnica di microiniezione ed elettroporazione e forniamo criteri “go” e “no-go” per eseguire l’elettroporazione di organoidi cerebrali di primati. Questo approccio è uno strumento efficace per studiare lo sviluppo (pato)fisiologico della neocorteccia e la sua evoluzione in un modello particolarmente vicino alla situazione umana.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le procedure qui descritte rappresentano un protocollo unificato per la generazione di organoidi cerebrali da diverse specie di primati con un approccio di elettroporazione mirato. Ciò consente l’espressione ectopica di un GOI in un sistema modello che emula lo sviluppo della neocorteccia (patofisiologica dei primati (incluso l’uomo) (umano). Questo protocollo unificato per la generazione di organoidi cerebrali di primati utilizza gli stessi materiali (ad esempio, media) e fasi di protocollo per tutte e quattro le speci…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ci scusiamo con tutti i ricercatori il cui lavoro non ha potuto essere citato a causa di limitazioni di spazio. Ringraziamo Ulrich Bleyer dei servizi tecnici di DPZ e Hartmut Wolf dell’officina di MPI-CBG per la costruzione delle camere degli elettrodi a piastre di Petri; Stoyan Petkov e Rüdiger Behr per aver fornito iPSC umane (iLonza2.2), macaco rhesus (iRh33.1) e uistitì (cj_160419_5); Sabrina Heide per la criosezione e la colorazione con immunofluorescenza; e Neringa Liutikaite e César Mateo Bastidas Betancourt per aver letto criticamente il manoscritto. Il lavoro nel laboratorio di W.B.H. è stato supportato da una sovvenzione ERA-NET NEURON (MicroKin). Il lavoro nel laboratorio di M.H. è stato sostenuto da una sovvenzione iniziale del CER (101039421).
Materials
| 20 µL Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck | 8.05740.0005 | |
| 35 mm cell culture dishes | Sarstedt | 83.3900 | |
| 60 mm cell culture dishes | CytoOne | CC7682-3359 | |
| Activin A | Sigma-Aldrich | SRP3003 | |
| AOC1 | Selleckchem | S7217 | |
| Axio Observer.Z1 Inverted Fluorescence Microscope | Zeiss | replacable by comparable fluorescent microscopes | |
| AZD0530 | Selleckchem | S1006 | |
| B-27 Supplement with Vitamin A (retinoic acid, RA) (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| B-27 Supplement without Vitamin A (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| BTX ECM 830 Square Wave Electroporation System | BTX | 45-2052 | |
| CGP77675 | Sigma-Aldrich | SML0314 | |
| Chimpanzee induced pluripotent stem cell line Sandra A | doi: 10.7554/elife.18683 | ||
| Common marmoset induced pluripotent stem cell line cj_160419_5 | doi: 10.3390/cells9112422 | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 11320-033 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-094 | pH 7.0−7.3; warm to room temperature before use |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Forskolin | Selleckchem | 2449 | |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050-061 | glutamine substitute supplement |
| Heparin (1 mg/mL stock) | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| Human induced pluripotent stem cell line iLonza2.2 | doi: 10.3390/cells9061349 | ||
| Human Neurotrophin-3 (NT-3) | PeproTech | 450-03 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| IWR1 | Sigma-Aldrich | I0161 | |
| Leica MS5 stereomicroscope (MDG 17 transmitted-light base) | Leica | 10473849 | replacable by comparable stereomicroscopes |
| Matrigel | Corning | 354277/354234 | basement membrane matrix; alternatively, Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302) can be used |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Sigma-Aldrich | M7145 | |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 818715 | handle with causion due to cancerogenecity |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | PanBiotech | P06-07100 | |
| Petri dish electrode chamber | self-produced (see Supplemental File 1) | also commertially available | |
| Pre-Pulled Glass Pipettes | WPI | TIP10LT | borosilicate glass pipettes with long taper, 10 µm tip diameter |
| Pro-Survival Compound | MerckMillipore | 529659 | |
| Recombinant Human/Murine/RatBrain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) | PeproTech | AF-450-02 | |
| Rhesus macaque induced pluripotent stem cell line iRh33.1 | doi: 10.3390/cells9061349 | ||
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotech | 130-104-368 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | proteolytic and collagenolytic enzyme mixture |
| TrypLE | Gibco | 12604-013 | recombinant trypsin substitute; warm to room temperature before use |
| Ultra-Low Attachment 96-well plates | Costar | 7007 | |
| Y27632 | Stemcell Technologies | 72305 |
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