Analyse af fluorescerende farvede lipiddråber med 3D-rekonstruktion til vurdering af hepatisk steatose

Summary

Heri demonstrerer vi en optimeret BODIPY 493/503 fluorescensbaseret protokol til lipiddråbekarakterisering i levervæv. Gennem brug af ortogonale projektioner og 3D-rekonstruktioner muliggør fluoroforen en vellykket skelnen mellem mikrovesikulær og makrovesikulær steatose og kan repræsentere en komplementær tilgang til de klassiske histologiske protokoller til vurdering af hepatisk steatose.

Abstract

Lipiddråber (LD’er) er specialiserede organeller, der formidler lipidopbevaring og spiller en meget vigtig rolle i undertrykkelse af lipotoksicitet og forebyggelse af dysfunktion forårsaget af frie fedtsyrer (FA’er). Leveren, givet sin kritiske rolle i kroppens fedtstofskifte, er vedvarende truet af den intracellulære akkumulering af LD’er i form af både mikrovesikulær og makrovesikulær hepatisk steatose. Den histologiske karakterisering af LD’er er typisk baseret på lipidopløselige diazofarvestoffer, såsom Oil Red O (ORO) farvning, men en række ulemper hæmmer konsekvent brugen af denne analyse med leverprøver. For nylig er lipofile fluoroforer 493/503 blevet populære til visualisering og lokalisering af LD’er på grund af deres hurtige optagelse og ophobning i den neutrale lipiddråbekerne. Selvom de fleste anvendelser er velbeskrevne i cellekulturer, er der mindre beviser, der viser pålidelig anvendelse af lipofile fluoroforprober som et LD-billeddannelsesværktøj i vævsprøver. Heri foreslår vi en optimeret bordipyrromethen (BODIPY) 493/503-baseret protokol til evaluering af LD’er i leverprøver fra en dyremodel af fedtfattig diæt (HFD)-induceret hepatisk steatose. Denne protokol dækker forberedelse af leverprøver, vævssektionering, BODIPY 493/503-farvning, billedoptagelse og dataanalyse. Vi demonstrerer et øget antal, intensitet, arealforhold og diameter af hepatiske LD’er ved HFD-fodring. Ved hjælp af ortogonale projektioner og 3D-rekonstruktioner var det muligt at observere det fulde indhold af neutrale lipider i LD-kernen, der fremstod som næsten sfæriske dråber. Desuden var vi med fluoroforen BODIPY 493/503 i stand til at skelne mikrovesikler (1 μm < d ≤ 3 μm), mellemliggende vesikler (3 μm 9 μm), hvilket muliggjorde en vellykket diskrimination af mikrovesikulær og makrovesikulær steatose. Samlet set er denne BODIPY 493/503 fluorescensbaserede protokol et pålideligt og simpelt værktøj til hepatisk LD-karakterisering og kan repræsentere en komplementær tilgang til de klassiske histologiske protokoller.

Introduction

Lipiddråber (LD’er), der klassisk betragtes som energidepoter, er specialiserede cellulære organeller, der formidler lipidlagring, og de omfatter en hydrofob neutral lipidkerne, som hovedsageligt indeholder kolesterolestere og triglycerider (TG’er), indkapslet af et phospholipidmonolag ^1,2,3.

LD-biogenese forekommer i det endoplasmatiske retikulum (ER), begyndende med syntesen af triacylglycerol (TAG) og sterolestere. Neutrale lipider diffunderes mellem folderne i ER-dobbeltlaget ved lave koncentrationer, men samles i olielinser, der vokser og knopper i næsten sfæriske dråber fra ER-membranen, når deres intracellulære koncentration stiger⁴. Derefter translokerer proteiner fra ER-dobbeltlaget og cytosolen, især perilipin (PLIN) proteinfamilien, til overfladerne af LD’erne for at lette spirende 5,6,7,8,9.

Gennem ny fedtsyresyntese og LD-fusion eller sammensmeltning vokser LD’er i forskellige størrelser. Derfor varierer størrelsen og antallet af LD’er betydeligt på tværs af forskellige celletyper. Små dråber (300-800 nm diameter), der er kendt som indledende LD’er (iLD’er), kan dannes af næsten alle celler⁴. Senere i LD-dannelsen er de fleste celler i stand til at konvertere nogle iLD’er til større dem-ekspanderende LD’er (eLD’er >1 μm i diameter). Alligevel har kun specifikke celletyper, såsom adipocytter og hepatocytter, kapacitet til at danne gigantiske eller overdimensionerede LD’er (op til snesevis af mikrometer i diameter)^4,10.

LD’er spiller en meget vigtig rolle i reguleringen af cellulær lipidmetabolisme, undertrykker lipotoksicitet og forhindrer ER-stress, mitokondriel dysfunktion og i sidste ende celledød forårsaget af frie fedtsyrer (FA’er)^11,12,13,14. Desuden har LD’er også været impliceret i reguleringen af genekspression, viral replikationsproteinbinding og membranhandel og signalering^15,16,17. Derfor er fejlregulering af LD-biogenese et kendetegn ved kroniske sygdomme forbundet med metabolisk syndrom, fedme, type 2-diabetes mellitus (T2DM) og / eller arteriosklerose, for blot at nævne nogle få^18,19,20.

Leveren, som et metabolisk knudepunkt, er for det meste ansvarlig for lipidmetabolisme ved opbevaring og behandling af lipider, og derfor trues den konstant af lipotoksicitet²¹. Hepatisk steatose (HS) er et fælles træk ved en række progressive leversygdomme og er karakteriseret ved overdreven intracellulær lipidakkumulering i form af cytosoliske LD’er, der i sidste ende kan føre til levermetabolisk dysfunktion, inflammation og avancerede former for ikke-alkoholisk fedtleversygdom^22,23,24,25. HS opstår, når hastigheden af fedtsyreoxidation og eksport som triglycerider inden for lipoproteiner med meget lav densitet (VLDL’er) er lavere end hastigheden af hepatisk fedtsyreoptagelse fra plasma- og de novo-fedtsyresyntesen ²⁶. Den hepatiske akkumulering af lipider forekommer ofte i to former – mikrovesikulær og makrovesikulær steatose – og disse viser forskellige cytoarkitektoniske egenskaber²⁷. Typisk er mikrovesikulær steatose karakteriseret ved tilstedeværelsen af små LD’er spredt gennem hepatocytten med kernen placeret centralt, mens makrovesikulær steatose er karakteriseret ved tilstedeværelsen af en enkelt stor LD, der optager størstedelen af hepatocytten og skubber kernen til periferien^28,29. Især findes disse to typer steatose ofte sammen, og det er stadig uklart, hvordan disse to LD-mønstre påvirker sygdomspatogenese, da beviser stadig er inkonsekvente^31,32,33,34. Alligevel anvendes en sådan type analyse ofte som en “referencestandard” i prækliniske og kliniske undersøgelser for at forstå LD’s dynamiske opførsel og karakterisere hepatisk steatose 29,34,35,36.

Leverbiopsier, guldstandarden til diagnosticering og klassificering af HS, vurderes rutinemæssigt ved histologisk hæmatoxylin og eosin (H&E) analyse, hvor lipiddråber evalueres som ufarvede vakuoler i H&E-farvet lever afsnit³⁷. Selvom det er acceptabelt til evaluering af makrovesikulær steatose, indsnævrer denne type farvning generelt vurderingen af mikrovesikulær steatose³⁸. Lipidopløselige diazofarvestoffer, såsom Oil Red O (ORO), kombineres klassisk med brightfieldmikroskopi for at analysere intracellulære lipidlagre, men disse har stadig en række ulemper: (i) brugen af ethanol eller isopropanol i farvningsprocessen, hvilket ofte forårsager forstyrrelse af de indfødte LD’er og lejlighedsvis fusion på trods af, at cellerne er fikseret³⁹; ii) den tidskrævende karakter, da ORO-opløsning kræver opløsning og filtrering af frisk pulver på grund af den begrænsede holdbarhed, hvilket bidrager til mindre ensartede resultater (iii) og det faktum, at ORO pletter mere end blot lipiddråber og ofte overvurderer hepatisk steatose³⁸.

Derfor er cellegennemtrængelige lipofile fluoroforer, såsom Nile Red, blevet anvendt i enten levende eller faste prøver for at overvinde nogle af de ovennævnte begrænsninger. Imidlertid indsnævrer den ikke-specifikke karakter af cellulær lipidorganelmærkning gentagne gange LD-vurderinger⁴⁰. Desuden varierer Nilens røde spektrale egenskaber alt efter miljøets polaritet, hvilket ofte kan føre til spektralforskydninger⁴¹.

Den lipofile fluorescerende sonde 1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4adiaza-s-indacene (excitationsbølgelængde: 480 nm; emissionsmaksimum: 515 nm; BODIPY 493/503) udviser hydrofobiske egenskaber, der tillader hurtig optagelse af intracellulære LD’er, akkumuleres i lipiddråbekernen og udsender derefter lysegrøn fluorescens¹². I modsætning til Nile Red er BODIPY 493/503 ufølsom over for miljøets polaritet og har vist sig at være mere selektiv, da den viser høj lysstyrke for LD-billeddannelse. For at plette neutrale LD’er kan dette farvestof anvendes i levende eller faste celler og med succes kombineres med andre farvnings- og / eller mærkningsmetoder⁴². En anden fordel ved farvestoffet er, at det kræver lidt indsats at placere i en opløsning og er stabilt, hvilket eliminerer behovet for frisk at forberede det til hvert eksperiment⁴². Selvom BODIPY 493/503-sonden med succes er blevet anvendt til at visualisere lokalisering og dynamik af LD’er i cellekulturer, har nogle rapporter også vist den pålidelige anvendelse af dette farvestof som et LD-billeddannelsesværktøj i væv, herunder den humane vastus lateralis-muskel⁴³, rottesoleus-muskelen⁴² og musetarmen⁴⁴.

Heri foreslår vi en optimeret BODIPY 493/503-baseret protokol som en alternativ analytisk tilgang til evaluering af LD-antal, areal og diameter i leverprøver fra en dyremodel af hepatisk steatose. Denne procedure dækker forberedelse af leverprøver, vævssektionering, farvningsbetingelser, billedoptagelse og dataanalyse.

Protocol

Alle dyreforsøg udført i denne undersøgelse blev godkendt af Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR) Animal Welfare Body (ORBEA, #9/2018) og overholdt Animal Care National og European Directive og ARRIVE-retningslinjerne. 1. Eksperimentelt design Parvis 13 uger gamle Wistar-hanrotter i ventilerede bure under kontrollerede miljøforhold med temperatur (22 °C ± 1 °C), fugtighed (50%-60%) og lys (12 timers lys-mørk cyklus) og med ad libi…

Representative Results

Den vellykkede udførelse af denne teknik bør resultere i klar lipiddråbefarvning til samtidig karakterisering af LD-morfologien (form og lipidkernetæthed baseret på 3D-rekonstruktionen) sammen med deres rumlige fordeling, antal pr. Samlet areal og gennemsnitlig størrelse (vurderet med rørledningen ovenfor beskrevet, figur 1). <stro…

Discussion

Denne BODIPY 493/503 fluorescensbaserede protokol til LD-vurdering havde til formål at udvikle en ny billeddannelsesmetode til evaluering af hepatisk steatose. I betragtning af den stærke sammenhæng mellem fedme og fedtleversygdom blev den vestlige diæt med højt fedtindhold brugt til at etablere en dyremodel for hepatisk steatose²⁶. En robust stigning i hepatisk TG-indhold blev bekræftet af et kvantitativt triglycerider kolorimetrisk assaykit, som foreslog et forhøjet hepatisk lipidosescena…

Materials

1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip set	Fisher Scientific
4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503)	Sigma-Aldrich, Lyon, France	D3922
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR	D1306
70% ethanol	Honeywell	10191455
Adobe Illustrator CC	Adobe Inc.	Used to design the figures
Automatic analyzer Hitachi 717	Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany	8177-30-0010
Barrier pen (Liquid blocker super pap pen)	Daido Sangyo Co., Ltd, Japon	_
Blade	Leica	221052145	Used in the cryostat
Cell Profiler version 4.2.5	https://cellprofiler.org/releases/	Used to analyse the acquired images
Coverslips	Menzel-Glaser, Germany	_
Cryomolds	Tissue-Tek	_
Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 S	Leica Biosystems	_
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich, Lyon, France	D-8418	Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.
Dry ice container (styrofoam cooler)	Novolab	A26742
Dumont forceps	Fine Science Tools, Germany	11295-10
Glass Petri dish (H 25 mm, ø 150 mm)	Thermo Scientific	150318	Used to weigh the liver after dissection
Glycergel	DAKO Omnis	S303023
GraphPad Prism software, version 9.3.1	GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA
High-fat diet	Envigo, Barcelona, Spain	MD.08811
Ketamine (Nimatek  100 mg/mL)	Dechra	791/01/14DFVPT	Used at a final concentration of 75 mg/kg
Laser scanning confocal microscope  (QUASAR detection unit; )	Carl Zeiss, germany	LSM 710 Axio Observer Z1 microscope
Medetomidine (Sedator 1 mg/mL)	Dechra	1838 ESP / 020/01/07RFVPT	Used at a final concentration of 1 mg/kg
Needle	BD microlance	300635
No 15 Sterile carbon steel scalpel Blade	Swann-Morton	205
Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil)	Carl Zeiss, Germany
Paint brushes	Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X	Used to handle cryosections
Peristaltic pump (Minipuls 3)	Gilson	1004170
Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4)	Sigma-Aldrich, Lyon, France	P3813
Scalpel handle, 125 mm (5"), No. 3	Swann-Morton	0208
Slide staining system StainTray	Simport Scientific	M920
Standard diet	Mucedola	4RF21
Superfrost Plus microscope slides	Menzel-Glaser, Germany	J1800AMNZ
Tissue-Tek OCT mounting media	VWR CHEMICALS	361603E
Triglycerides colorimetric assay kit	Cayman Chemical	10010303
Ultrasonic bath	Bandelin Sonorex	TK 52
Vannas spring scissors – 3 mm cutting edge	Fine Science Tools, Germany	15000-00
ZEN Black software	Zeiss