Summary
Qui, dimostriamo un protocollo ottimizzato basato sulla fluorescenza BODIPY 493/503 per la caratterizzazione delle goccioline lipidiche nel tessuto epatico. Attraverso l'uso di proiezioni ortogonali e ricostruzioni 3D, il fluoroforo consente una discriminazione di successo tra steatosi microvescicolare e macrovescicolare e può rappresentare un approccio complementare ai protocolli istologici classici per la valutazione della steatosi epatica.
Abstract
Le goccioline lipidiche (LD) sono organelli specializzati che mediano l'accumulo lipidico e svolgono un ruolo molto importante nel sopprimere la lipotossicità e prevenire le disfunzioni causate dagli acidi grassi liberi (FA). Il fegato, dato il suo ruolo critico nel metabolismo dei grassi del corpo, è costantemente minacciato dall'accumulo intracellulare di LD sotto forma di steatosi epatica sia microvescicolare che macrovescicolare. La caratterizzazione istologica delle LD si basa tipicamente su coloranti diazo liposolubili, come la colorazione Oil Red O (ORO), ma una serie di svantaggi ostacola costantemente l'uso di questa analisi con campioni di fegato. Più recentemente, i fluorofori lipofili 493/503 sono diventati popolari per visualizzare e localizzare le LD a causa del loro rapido assorbimento e accumulo nel nucleo delle goccioline lipidiche neutre. Anche se la maggior parte delle applicazioni sono ben descritte in colture cellulari, ci sono meno prove che dimostrano l'uso affidabile di sonde fluorofore lipofile come strumento di imaging LD in campioni di tessuto. Qui, proponiamo un protocollo ottimizzato basato su dipirrometene di boro (BODIPY) 493/503 per la valutazione delle LD in campioni di fegato da un modello animale di steatosi epatica indotta da dieta ricca di grassi (HFD). Questo protocollo copre la preparazione del campione di fegato, il sezionamento dei tessuti, la colorazione BODIPY 493/503, l'acquisizione delle immagini e l'analisi dei dati. Dimostriamo un aumento del numero, dell'intensità, del rapporto di area e del diametro delle LD epatiche durante l'alimentazione HFD. Utilizzando proiezioni ortogonali e ricostruzioni 3D, è stato possibile osservare l'intero contenuto di lipidi neutri nel nucleo LD, che apparivano come goccioline quasi sferiche. Inoltre, con il fluoroforo BODIPY 493/503, siamo stati in grado di distinguere microvescicole (1 μm < d ≤ 3 μm), vescicole intermedie (3 μm < d ≤ 9 μm) e macrovescicole (d > 9 μm), consentendo la corretta discriminazione della steatosi microvescicolare e macrovescicolare. Nel complesso, questo protocollo basato sulla fluorescenza BODIPY 493/503 è uno strumento affidabile e semplice per la caratterizzazione epatica della LD e può rappresentare un approccio complementare ai protocolli istologici classici.
Introduction
Le goccioline lipidiche (LD), classicamente viste come depositi di energia, sono organelli cellulari specializzati che mediano l'accumulo di lipidi e comprendono un nucleo lipidico neutro idrofobico, che contiene principalmente esteri di colesterolo e trigliceridi (TG), incapsulati da un monostrato fosfolipidico 1,2,3.
La biogenesi LD avviene nel reticolo endoplasmatico (ER), iniziando con la sintesi di triacilglicerolo (TAG) ed esteri sterolici. I lipidi neutri sono diffusi tra i lembi del doppio strato ER a basse concentrazioni, ma si fondono in lenti oleose che crescono e germogliano in goccioline quasi sferiche dalla membrana ER quando la loro concentrazione intracellulare aumenta4. Successivamente, le proteine del doppio strato ER e del citosol, in particolare la famiglia delle proteine perilipina (PLIN), traslocano sulle superfici delle LD per facilitare il germogliamentodi 5,6,7,8,9.
Attraverso la nuova sintesi degli acidi grassi e la fusione o la coalescenza delle LD, le LD crescono in diverse dimensioni. Di conseguenza, la dimensione e il numero di LD differiscono considerevolmente tra i diversi tipi di cellule. Piccole goccioline (300-800 nm di diametro), note come LD iniziali (iLD), possono essere formate da quasi tutte le cellule4. Più tardi nella formazione delle LD, la maggior parte delle cellule è in grado di convertire alcune iLD in LD più grandi che espandono (eLD >1 μm di diametro). Tuttavia, solo specifici tipi di cellule, come adipociti ed epatociti, hanno la capacità di formare LD giganti o sovradimensionati (fino a decine di micron di diametro)4,10.
Le LD svolgono un ruolo molto importante nella regolazione del metabolismo lipidico cellulare, sopprimendo la lipotossicità e prevenendo lo stress ER, la disfunzione mitocondriale e, infine, la morte cellulare causata dagli acidi grassi liberi (FA)11,12,13,14. Inoltre, le LD sono state anche implicate nella regolazione dell'espressione genica, nel sequestro delle proteine di replicazione virale e nel traffico e nella segnalazione di membrana15,16,17. Pertanto, l'errata regolazione della biogenesi della LD è un segno distintivo delle malattie croniche associate alla sindrome metabolica, all'obesità, al diabete mellito di tipo 2 (T2DM) e / o all'arteriosclerosi, per citarne solo alcuni18,19,20.
Il fegato, come hub metabolico, è principalmente responsabile del metabolismo lipidico immagazzinando ed elaborando i lipidi e, quindi, è costantemente minacciato dalla lipotossicità21. La steatosi epatica (HS) è una caratteristica comune di una serie di malattie epatiche progressive ed è caratterizzata da un eccessivo accumulo di lipidi intracellulari sotto forma di LD citosoliche che, in definitiva, possono portare a disfunzione metabolica epatica, infiammazione e forme avanzate di steatosi epatica non alcolica22,23,24,25. L'HS si verifica quando il tasso di ossidazione ed esportazione degli acidi grassi come trigliceridi all'interno delle lipoproteine a bassissima densità (VLDL) è inferiore al tasso di assorbimento degli acidi grassi epatici dal plasma e dalla sintesi de novo degli acidi grassi26. L'accumulo epatico di lipidi si presenta spesso in due forme - steatosi microvescicolare e macrovescicolare - e queste mostrano caratteristiche citoarchitettoniche distinte27. Tipicamente, la steatosi microvescicolare è caratterizzata dalla presenza di piccole LD disperse in tutto l'epatocita con il nucleo posto centralmente, mentre la steatosi macrovescicolare è caratterizzata dalla presenza di un unico grande LD che occupa la maggior parte dell'epatocita, spingendo il nucleo verso la periferia28,29. In particolare, questi due tipi di steatosi si trovano spesso insieme, e non è chiaro come questi due modelli LD influenzino la patogenesi della malattia, poiché le prove sono ancora incoerenti31,32,33,34. Tuttavia, tale tipo di analisi è spesso impiegato come "standard di riferimento" negli studi preclinici e clinici per comprendere il comportamento dinamico delle LD e caratterizzare la steatosi epatica 29,34,35,36.
Le biopsie epatiche, il gold standard per la diagnosi e la classificazione dell'HS, sono valutate di routine mediante analisi istologica dell'ematossilina e dell'eosina (H & E), dove le goccioline lipidiche sono valutate come vacuoli non colorati nelle sezioni epatiche colorate con H & E37. Sebbene accettabile per la valutazione della steatosi macrovescicolare, questo tipo di colorazione generalmente restringe la valutazione della steatosi microvescicolare38. I coloranti diazo liposolubili, come Oil Red O (ORO), sono classicamente combinati con la microscopia a campo chiaro per analizzare le riserve lipidiche intracellulari, ma questi hanno ancora una serie di svantaggi: (i) l'uso di etanolo o isopropanolo nel processo di colorazione, che spesso causa l'interruzione delle LD native e la fusione occasionale nonostante le cellule siano fissate39; ii) la natura dispendiosa in termini di tempo, in quanto la soluzione ORO richiede la dissoluzione e il filtraggio della polvere fresca a causa della limitata durata di conservazione, contribuendo così a risultati meno coerenti; (iii) e il fatto che ORO colora più di semplici goccioline lipidiche e spesso sovrastima la steatosi epatica38.
Di conseguenza, i fluorofori lipofili permeabili alle cellule, come il rosso del Nilo, sono stati utilizzati in campioni vivi o fissi per superare alcune delle limitazioni di cui sopra. Tuttavia, la natura non specifica della marcatura degli organelli lipidici cellulari restringe ripetutamente le valutazioni LD40. Inoltre, le proprietà spettrali del rosso Nilo variano a seconda della polarità dell'ambiente, che spesso può portare a spostamenti spettrali41.
La sonda fluorescente lipofila 1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4adiaza-s-indacene (lunghezza d'onda di eccitazione: 480 nm; emissione massima: 515 nm; BODIPY 493/503) presenta caratteristiche di idrofobicità che ne consentono il rapido assorbimento da parte delle LD intracellulari, si accumula nel nucleo delle goccioline lipidiche e, successivamente, emette fluorescenza verde brillante12. A differenza del Nilo Red, BODIPY 493/503 è insensibile alla polarità ambientale e ha dimostrato di essere più selettivo, in quanto mostra un'elevata luminosità per l'imaging LD. Al fine di colorare LD neutri, questo colorante può essere utilizzato in cellule vive o fisse e accoppiato con successo con altri metodi di colorazione e / o etichettatura42. Un altro vantaggio del colorante è che richiede poco sforzo per essere inserito in una soluzione ed è stabile, eliminando così la necessità di prepararlo fresco per ogni esperimento42. Anche se la sonda BODIPY 493/503 è stata impiegata con successo per visualizzare la localizzazione e la dinamica delle LD nelle colture cellulari, alcuni rapporti hanno anche dimostrato l'uso affidabile di questo colorante come strumento di imaging LD in tessuti tra cui il muscolo del vasto laterale umano43, il muscolo soleo del ratto 42 e l'intestino del topo44.
Qui, proponiamo un protocollo ottimizzato basato su BODIPY 493/503 come approccio analitico alternativo per la valutazione del numero, dell'area e del diametro LD in campioni di fegato da un modello animale di steatosi epatica. Questa procedura copre la preparazione del campione di fegato, il sezionamento dei tessuti, le condizioni di colorazione, l'acquisizione di immagini e l'analisi dei dati.
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Protocol
Tutte le procedure animali eseguite in questo studio sono state approvate dall'Istituto di Coimbra per la ricerca clinica e biomedica (iCBR) Animal Welfare Body (ORBEA, # 9/2018) e conformi alle direttive nazionali ed europee sulla cura degli animali e alle linee guida ARRIVE.
1. Progettazione sperimentale
- Coppia di ratti Wistar maschi di 13 settimane in gabbie ventilate in condizioni ambientali controllate di temperatura (22 °C ± 1 °C), umidità (50%-60%) e luce (ciclo luce-buio 12 ore) e con accesso ad libitum all'acqua del rubinetto e al chow standard per roditori.
- Dopo un periodo di acclimatazione di 2 settimane, assegnare arbitrariamente i ratti in due gruppi.
- Alimentare i gruppi di controllo (CTRL, n = 6) e dieta ricca di grassi (HFD, n = 6) con chow standard e una dieta ricca di grassi (45% kcal / grasso), rispettivamente, per 24 settimane.
- Monitorare il peso corporeo (BW) settimanalmente. Registrare il consumo giornaliero di cibo e bevande per gabbia.
2. Preparazione del campione di fegato
- Dissezione epatica
- Preparare la pompa peristaltica: far passare il 70% di etanolo attraverso il tubo, collegare un ago da 27 G all'estremità di uscita del tubo e innescare il tubo con soluzione salina ghiacciata (4 °C) tamponata con fosfato (PBS, pH ~ 7,4) (ad esempio, 200 giri / min su una pompa peristaltica con tubo in silicio ID da 1,6 mm, mini set di gocciolamento IV). Regolare il peso corporeo (ad esempio, per un ratto di 100-150 g, utilizzare una portata di circa 10-12 ml / min).
- Anestetizzare il ratto mediante iniezione intraperitoneale utilizzando un protocollo di anestesia (la concentrazione finale di ketamina = 75 mg/kg e la concentrazione finale di medetomidina = 1 mg/kg).
NOTA: Assicurarsi che il ratto sia completamente anestetizzato utilizzando il metodo di risposta al pizzico della punta. - Posizionare il topo sul vassoio di dissezione.
- Disinfettare accuratamente la pelliccia con etanolo al 70% e asciugarla con un tovagliolo di carta.
- Usando le forbici, fai un'incisione a forma di "U" attraverso la pelle e taglia sotto il diaframma. Quindi, tagliare la gabbia toracica rostralmente sui bordi per esporre il cuore.
- Mentre il PBS 1x è in esecuzione, passare l'ago attraverso il ventricolo sinistro nell'aorta ascendente e morsetto. Quindi, l'atrio destro viene tagliato per consentire il drenaggio una volta iniziata la perfusione.
NOTA: Il fegato dovrebbe iniziare a sbiancarsi quando il sangue viene sostituito con PBS. - Usando forbici e pinze Dumont, rimuovere accuratamente il fegato e risciacquare con 1x PBS.
- Trasferire il fegato su una capsula di Petri e pesarlo.
- Utilizzando un bisturi, raccogliere campioni di tessuto epatico di 5 mm di spessore dal lato laterale (1 cm dal bordo) del lobo sinistro del fegato per il processo di incorporazione.
NOTA Il tessuto rimanente può essere conservato a -80 °C per la conservazione a lungo termine.
- Incorporazione del tessuto epatico
- Preparare un contenitore di ghiaccio secco ed etichettare correttamente i criostampi con l'ID e l'orientamento del campione.
- Posizionare alcune gocce di matrice di crioincorporazione al centro del criomold per ottenere la temperatura di taglio ottimale (OCT).
- Assicurarsi che il campione di tessuto sia correttamente orientato per una sezione trasversale.
NOTA: Assicurarsi che il lato che tocca la parte inferiore del criomold sia il lato che verrà sezionato per primo. - Rilasciare con cautela più OCT sul criomold fino a quando non è completamente coperto. Cerca di evitare la formazione di bolle d'aria. Se necessario, con una pinza semplice, rimuovere eventuali bolle all'interno dello Pt.
- Posizionare rapidamente il criomold con il campione coperto di OCT in un contenitore di ghiaccio secco.
NOTA: I tessuti possono essere conservati a -80 °C per 3 anni.
3. Sezionamento di tessuti congelati
- Regolare la temperatura del criostato (camera: -21 °C; campione: -18 °C) e inserire una nuova lama sterile.
- Posizionare i campioni nel criostato per 30 minuti prima di consentire l'equilibrio della temperatura.
- Creare un singolo strato di OCT sul disco del campione per consentire l'adesione del campione. Lasciare congelare lo Strumento di personalizzazione di Office e montare il campione di tessuto nell'orientamento desiderato.
NOTA: la superficie di taglio deve essere parallela alla lama. Per mantenere una buona adesione, posizionare l'estrattore di calore sulla parte superiore del campione. I passaggi precedenti possono anche essere eseguiti in un contenitore di ghiaccio secco con ghiaccio secco. - Posizionare il campione nella testa del campione e tagliare la superficie del tessuto (alcune sezioni di campione di tessuto da 30 μm).
- Una volta che la regione di interesse è accessibile per il sezionamento, tagliare sezioni spesse 12 μm e posizionarle su vetrini da microscopio etichettati mantenuti a temperatura ambiente (RT).
NOTA: per raccogliere la sezione, spostare lentamente il vetrino verso la sezione del tessuto. Ogni vetrino può raccogliere due sezioni di fegato. - Lasciare asciugare i vetrini per 10 minuti a RT.
NOTA: I vetrini possono essere conservati a -20 °C per 6-12 mesi o a -80 °C per un massimo di 3 anni.
4. Colorazione BODIPY
- Scongelare i vetrini in un sistema di colorazione dei vetrini a RT per 30 minuti.
- Lavare con 1x PBS (3x per 5 minuti ciascuno).
- Circondare la sezione con uno strato idrofobo usando una penna barriera.
- Preparare 500 μg/mL di BODIPY 493/503 soluzione madre: sciogliere 1 mg di BODIPY 493/503 in 2 mL di solvente (90% DMSO; 10% 1x PBS). Proteggere dalla luce. Sonicare in un bagno ad ultrasuoni per 1 ora (9,5-10 W) a 37 °C.
NOTA: La soluzione può essere conservata a -20 °C per almeno 30 giorni. - Preparare la soluzione colorante BODIPY (1 μg/ml) aggiungendo 2 μL di soluzione madre BODIPY 493/503 e 0,1 μL di soluzione madre DAPI (5 mg/ml) a 997,9 μL di 1x PBS.
- Incubare i vetrini (75 μL/vetrino) con BODIPY 493/503 (1 μg/mL) e DAPI (0,1 μg/mL) a RT per 40 minuti.
NOTA: tenere le diapositive al buio da questo passaggio in poi. - Lavare i vetrini con 1x PBS (3x per 5 minuti ciascuno).
- Montare i vetrini con vetrini utilizzando un mezzo di montaggio a fluorescenza, lasciarli asciugare per 30 minuti e sigillarli con lo smalto.
NOTA: I vetrini possono essere conservati a 4 °C fino all'imaging.
5. Quantificazione dei lipidi
- Misurare i livelli sierici di colesterolo totale e TG utilizzando un metodo e un'apparecchiatura automatici e convalidati.
- Misurare i livelli di TG epatici utilizzando un kit di analisi colorimetrica dei trigliceridi (Table of Materials) secondo il protocollo del produttore.
6. Acquisizione di immagini
- Posizionare il vetrino sul supporto del vetrino del microscopio confocale a scansione laser.
- Per la visualizzazione e l'acquisizione delle immagini, utilizzare un microscopio confocale con obiettivo 20x (planimetria-apocromatica: 20x/0,8).
- Per evitare la diafonia tra BODIPY 493/503 e DAPI, utilizzare la modalità di scansione sequenziale (segnale migliore) sul software confocale.
- Emoziona il BODIPY 593/503 utilizzando la linea laser argon da 488 nm e il DAPI utilizzando la linea laser a 405 nm. Impostare gli intervalli di emissione a 493-589 nm per BODIPY 493/503 e a 410-464 nm per DAPI.
- Utilizzare le seguenti impostazioni: foro stenopeico: 1 UA, risoluzione: 1.024 pixel x 1.024 pixel, profondità di bit: 12, dimensione pixel: 0,415 μm, modalità bidirezionale, velocità di scansione: 7 (~ 1,58 μs/pixel per un obiettivo 20x), media lineare: 2x e zoom digitale: 1.
NOTA: I suddetti parametri di scansione devono essere ottimizzati per ogni microscopio confocale e obiettivo utilizzato. - Impostare il guadagno e il guadagno digitale in modo appropriato in modo che non vengano rilevati pixel saturi sull'indicatore di intervallo.
NOTA: correggere il segnale di fondo regolando l'offset. - Una volta identificati correttamente i LD, acquisire l'immagine con i canali BODIPY e DAPI.
NOTA: Tutte le immagini devono essere acquisite nelle stesse condizioni (esposizione e impostazioni generali) per ogni canale colore. - Per creare immagini ad ampia area (Figura 2), modificare l'obiettivo con obiettivo a10x (plan-neofluar: 10x/0.3).
- Seleziona la modalità Tile Scan e crea mosaici di 5 immagini per 5.
NOTA: in questo lavoro, ogni riquadro aveva una sovrapposizione del 10% per unire in modo appropriato le tessere per l'analisi. - Per creare viste 3D e ortogonali (Figura 3A), posizionare una goccia di olio ad immersione sulla parte superiore del vetro di copertura e modificare l'obiettivo con una lente obiettivo 40x (plan-neofluar: olio 40x/1,30).
- Selezionare la modalità Z-Stack e, regolando il piano Z, definire la prima e l'ultima posizione per l'acquisizione con una fetta ottica a uno spessore ottimale (~0,5 μm) per garantire che tutte le goccioline vengano catturate.
NOTA: Per velocizzare l'acquisizione dell'immagine ed evitare lo sbiancamento, la fetta ottica può essere regolata su una dimensione non ottimale, garantendo almeno il 30% di sovracampionamento per una buona ricostruzione 3D. - Selezionate il modulo Orto e create viste ortogonali.
- Acquisisci immagini 3D selezionando il modulo 3D seguendo la modalità di rendering della trasparenza con il software del microscopio confocale.
7. Analisi delle immagini
- Elaborare e analizzare le immagini single-plane (ingrandimento 20x) con CellProfiler (versione 4.2.5).
NOTA: La pipeline utilizzata in questo lavoro è stata adattata da Adomshick et al.45. - Fare clic sul modulo Immagini nell'angolo in alto a sinistra della finestra di CellProfiler e caricare le immagini come file .tiff.
- Utilizzare il modulo NamesAndTypes per ordinare tra immagini colorate BODIPY- (droplet) e DAPI- (nuclei) in base ai nomi dei file. Eseguire l'analisi LD solo con immagini colorate con BODIPY.
- Per avviare la costruzione della pipeline, fare clic su Regola moduli e selezionare il modulo ColorToGray per convertire le immagini in immagini in scala di grigi.
NOTA: per identificare gli oggetti, sono necessarie immagini in scala di grigi. - Identificare le goccioline utilizzando il modulo IdentifyPrimaryObjects utilizzando l'immagine in scala di grigi.
NOTA: i parametri in questo modulo devono essere regolati per ottenere una buona identificazione LD. In questo lavoro, la definizione di LD con una dimensione compresa tra 6 pixel e 300 pixel e un fattore di correzione soglia di 1,0 ha portato all'identificazione più accurata. - Per misurare l'intensità dei pixel delle goccioline lipidiche identificate, aggiungere un modulo MeasureObjectIntensity .
- Aggiungere un modulo FilterObjects aggiuntivo per garantire che vengano quantificati solo i segnali più forti mentre i segnali meno intensi siano esclusi dall'analisi finale delle goccioline lipidiche (intensità minima: 0,15; intensità massima: 1 unità arbitraria).
- Per misurare i LD correlati ai dati di output, aggiungere il modulo MeasureObjectSizeShape .
- Aggiungi un modulo OverlayOutlines a questo punto per sovrapporre la goccia identificata sull'immagine originale e, quindi, assicurati che la segmentazione appaia accurata anche sull'immagine non elaborata.
NOTA: questo è un passaggio facoltativo (controllo qualità). - Aggiungi un modulo ExportToSpreadsheet alla fine e fai clic sul pulsante Analizza immagini nell'angolo in basso a sinistra.
8. Analisi statistica
- Esprimere i risultati come media ± errore standard della media (S.E.M.) utilizzando qualsiasi applicazione software di analisi statistica.
NOTA: In questo studio, il software GraphPad è stato utilizzato per l'analisi statistica. - Analizzare la distribuzione dei valori utilizzando il test di Kolmogorov-Smirnov per valutare deviazioni significative dalla normalità. Analizzare i dati parametrici utilizzando il t-test spaiato dello studente.
NOTA: valori di p < 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi.
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Representative Results
L'esecuzione di successo di questa tecnica dovrebbe comportare una chiara colorazione delle goccioline lipidiche per la caratterizzazione simultanea della morfologia LD (forma e densità del nucleo lipidico basata sulla ricostruzione 3D) insieme alla loro distribuzione spaziale, numero per area totale e dimensione media (valutata con la pipeline sopra descritta, Figura 1).
Figura 1: Elaborazione di immagini di esempio utilizzando CellProfiler . (A) Immagine originale di LD colorate con BODIPY 493/503 (verde) e nuclei colorati con DAPI (blu) nel gruppo CTL. (B) I LD differenziati (magenta) del gruppo CTL sono stati sovrapposti utilizzando il modulo OverlayOutlines . (C) Immagine originale di LD colorate con BODIPY 493/503 (verde) e nuclei colorati con DAPI (blu) nel gruppo HFD. (D) I LD differenziati (magenta) del gruppo HFD sono stati sovrapposti utilizzando il modulo OverlayOutlines . Le immagini sono state scattate con un ingrandimento 20x utilizzando un microscopio confocale a scansione laser point. Barre della scala = 50 μm. Abbreviazioni: CTL = gruppo di controllo; HFD = gruppo di dieta ricca di grassi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Sono stati valutati i TG sierici, il colesterolo totale, LDL-c, HDL-c e il contenuto di TG epatici (Tabella 1). Gli animali alimentati con HFD presentavano un profilo dislipidemico pronunciato, caratterizzato da un accentuato accumulo di TG epatici (345% rispetto a CTL, p < 0,001), insieme a un lieve aumento dei livelli di TG circolanti (129% rispetto a CTL, p > 0,05).
| Parametro | CTL | HFD | |
| Siero | |||
| Colesterolo totale (mg / dL) | 56,67 ± 9,35 | 80,40 ± 7,45 | |
| LDL (mg/dL) | 7,66 ± 0,84 | 7.40 ± 1.03 | |
| HDL (mg/dL) | 17.83 ± 2.93 | 28,40 ± 2,40 * | |
| Trigliceridi (mg/dL) | 154,8 ± 40,17 | 201,2 ± 38,12 | |
| Fegato | |||
| Trigliceridi (mg/g) | 15.29 ± 1.31 | 52,83 ± 6,73 *** |
Tabella 1: TG sierici, colesterolo totale, LDL-c, HDL-c e contenuto di TG epatico. I dati sono espressi come media ± SEM (n = 5-6 per gruppo). p < 0,001 rispetto a CTL. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il test t spaiato di uno studente. Abbreviazioni: CTL = gruppo di controllo; HFD = gruppo di dieta ricca di grassi.
La Figura 2 mostra immagini rappresentative ad ampia area (scansioni di piastrelle con obiettivo 10x) di sezioni epatiche in cui le LD sono colorate con BODIPY 493/503 (verde) e i nuclei sono colorati con DAPI (blu). Singoli LD di varie dimensioni sono stati visualizzati con successo con colorazione BODIPY 493/503, che ha mostrato un modello di distribuzione diffuso negli animali alimentati con HFD.
Figura 2: Immagini rappresentative dell'accumulo di LD nel tessuto epatico. LD colorati con BODIPY 493/503 (verde) e nuclei colorati con DAPI (blu). Le immagini sono state scattate con un ingrandimento 10x utilizzando un microscopio confocale a scansione laser point. Barre della scala = 200 μm. Abbreviazioni: CTL = gruppo di controllo; HFD = gruppo di dieta ricca di grassi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
La Figura 3A mostra proiezioni ortogonali rappresentative con un obiettivo 20x e immagini 3D con un obiettivo 40x di LD epatiche. Le immagini a piano singolo sono state elaborate e analizzate da CellProfiler (versione 4.2.5) per valutare l'intensità della fluorescenza, il numero, l'area e il diametro dei LC (Figura 3B-E). È stato possibile confermare che gli animali alimentati con HFD mostravano un aumento del numero di LD epatiche (151% vs CTL, Figura 3B), e ciò è stato confermato dall'aumentata intensità di fluorescenza BODIPY 493/503 (182% vs CTL, p < 0,001, Figura 3C). Inoltre, il rapporto di area delle LD è quasi triplicato (360% vs. CTL, p < 0,0001, Figura 3D) in quanto presentavano diametri maggiori (182% vs. CTL, Figura 3E) negli animali alimentati con HFD. Per valutare la distribuzione dimensionale, i LD sono stati classificati in tre gruppi in base agli intervalli di diametro: 1 μm < d ≤ 3 μm, 3 μm < d ≤ 9 μm e d > 9 μm (Figura 3F). Gli animali alimentati con HFD hanno mostrato un aumento superiore al 20% del numero di LD epatiche macrovescicolari di grandi dimensioni (d > 9 μm, p < 0,0001) insieme a una riduzione di quasi tre volte del numero di microvescicole di diametro inferiore a 3 μm (1 μm < d ≤ 3 μm, p < 0,0001).
Figura 3: Viste ortogonali/3D dei LD e analisi dei dati. (A) Proiezioni ortogonali rappresentative e immagini 3D di goccioline lipidiche epatiche (verde, BODIPY 493/503) e nuclei (blu, DAPI) nel fegato di topi alimentati con una dieta normale o HFD. Le immagini sono state scattate con un ingrandimento di 20x (a sinistra) e 40x (a destra) utilizzando un microscopio confocale a scansione laser point. Barre della scala = 20 μm. (B) Numero di LD epatiche. (C) Intensità di fluorescenza delle LD epatiche. (D) Rapporto di area delle LD epatiche. (E) Diametri delle goccioline lipidiche. (F) Rapporti frazionari di gruppi di goccioline lipidiche epatiche con diametri diversi: 1 μm < d ≤ 3 μm, 3 μm < d ≤ 9 μm e d > 9 μm. I dati sono presentati come media ± SEM. n = 5-6 topi/gruppo; * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il test t spaiato di uno studente. Abbreviazioni: CTL = gruppo di controllo; HFD = gruppo di dieta ricca di grassi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo basato sulla fluorescenza BODIPY 493/503 per la valutazione della LD mirava a sviluppare un nuovo approccio di imaging per la valutazione della steatosi epatica. Data la forte correlazione tra obesità e steatosi epatica, la dieta ricca di grassi in stile occidentale è stata utilizzata per stabilire un modello animale di steatosi epatica26. Un robusto aumento del contenuto di TG epatici è stato confermato da un kit di test colorimetrici quantitativi dei trigliceridi, che ha suggerito uno scenario di lipidosi epatica accentuata negli animali alimentati con HFD. Successivamente, il grado di accumulo di LD è stato visualizzato dalla sonda fluorescente BODIPY 493/503 a basso ingrandimento. Come previsto, la colorazione BODIPY 493/503 ha rivelato una distribuzione diffusa delle strutture vescicolari attraverso il tessuto epatico nel gruppo HFD. Ricorrendo a proiezioni ortogonali e ricostruzioni 3D, è stato possibile osservare che il nucleo LD presentava un contenuto pieno di lipidi neutri, che apparivano come goccioline quasi sferiche. Inoltre, il robusto aumento dell'area LD per area totale era chiaramente evidente (360% rispetto al gruppo CTL), e quest'area era molto probabilmente piena di TG neutri dato il loro punteggio quantitativo nel gruppo HFD (52,83 mg / g ± 6,73 mg / g; 346% rispetto al gruppo CTL). Per caratterizzare ulteriormente la dinamica LD dopo l'alimentazione HFD, è stata analizzata la natura micro o macrovescicolare della steatosi epatica. Utilizzando gli intervalli di diametro LD precedentemente descritti in letteratura 4,46,47, è stato possibile discriminare un calo significativo della conta LD microvescicolare (1 μm < d ≤ 3 μm), che ha accompagnato un aumento proporzionale delle macrovescicole LD (d > 9 μm). Diversi studi hanno riportato che le LD negli epatociti possono formare LD sovradimensionate (fino a decine di micron di diametro)4,46,47, il che è in linea con i risultati attuali.
Negli ultimi anni, i coloranti lipidici classici sono stati gradualmente sostituiti con una nuova schiera di sonde lipofile fluorescenti, come BODIPY, data la loro struttura neutra e planare stabilizzata da un complesso di difluoroboro48; queste sonde hanno dimostrato di essere molto efficaci nel marcare le LD per studiarne la morfologia, la dinamica e l'interazione con altri organelli nelle cellule viventi e in alcuni tessuti fissi 49,50. All'interno del protocollo delle goccioline lipidiche colorate con fluorescenza qui presentato per la valutazione della steatosi epatica, ci sono alcuni passaggi critici per il successo della tecnica che si basano principalmente sulla preparazione dei tessuti e sull'acquisizione di immagini. Poiché il segnale BODIPY può essere sbiancato dalla luce UV51, l'acquisizione dell'imaging LD deve avvenire prima di visualizzare altri coloranti fluorescenti eccitati dalla luce UV, come i coloranti fluorescenti a DNA comunemente noti. Inoltre, si raccomanda vivamente di proteggere i vetrini del microscopio dall'esposizione alla luce al fine di prevenire la tempra della fluorescenza BODIPY prima dell'imaging. Anche se la ricostruzione 3D dei LD è molto utile per lo studio della loro morfologia, è estremamente dispendiosa in termini di tempo, poiché le immagini ricostruite in 3D sono composte da diverse immagini 2D indipendenti. Pertanto, i ricercatori dovrebbero considerare di evitare questo passaggio quando l'obiettivo primario dell'esperimento è esclusivamente la valutazione della steatosi epatica micro e macrovescicolare. Per evitare pregiudizi, due osservatori indipendenti in cieco al gruppo di trattamento dovrebbero effettuare l'acquisizione e l'analisi dei dati. Il software di elaborazione delle immagini semi-automatico (pipeline Cell Profiler) contribuisce ulteriormente a una quantificazione semi-cieca e supera l'aumento del tempo di elaborazione costantemente osservato nell'analisi manuale.
Questa tecnica può essere estesa ad applicazioni più ampie in combinazione con la colorazione immunoistochimica di altri tessuti e specie, purché le concentrazioni ottimali di BODIPY e le impostazioni di acquisizione delle immagini siano state determinate per massimizzare il rapporto segnale/fondo. Tali impostazioni sperimentali possono consentire la rilevazione simultanea di altri antigeni a condizione che il secondo fluoroforo utilizzato non si sovrapponga agli spettri di eccitazione/emissione di BODIPY.
Nel complesso, il protocollo ottimizzato basato sulla fluorescenza BODIPY 493/503 qui presentato è uno strumento affidabile e semplice per la caratterizzazione delle LD e può rappresentare un approccio complementare ai protocolli istologici classici spesso impiegati per confermare e classificare la steatosi epatica.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata finanziata da fondi nazionali ed europei attraverso la Fondazione portoghese per la scienza e la tecnologia (FCT), il Fondo europeo di sviluppo regionale (FEDER) e il Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE): 2020.09481.BD, UIDP / 04539/2020 (CIBB) e POCI-01-0145-FEDER-007440. Gli autori desiderano ringraziare il supporto di iLAB - Microscopy and Bioimaging Lab, una struttura della Facoltà di Medicina dell'Università di Coimbra e membro dell'infrastruttura nazionale PPBI-Portuguese Platform of BioImaging (POCI-01-0145-FEDER-022122), nonché il supporto di FSE CENTRO-04-3559-FSE-000142.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip set | Fisher Scientific | ||
| 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | D3922 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR | D1306 | |
| 70% ethanol | Honeywell | 10191455 | |
| Adobe Illustrator CC | Adobe Inc. | Used to design the figures | |
| Automatic analyzer Hitachi 717 | Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany | 8177-30-0010 | |
| Barrier pen (Liquid blocker super pap pen) | Daido Sangyo Co., Ltd, Japon | _ | |
| Blade | Leica | 221052145 | Used in the cryostat |
| Cell Profiler version 4.2.5 | https://cellprofiler.org/releases/ | Used to analyse the acquired images | |
| Coverslips | Menzel-Glaser, Germany | _ | |
| Cryomolds | Tissue-Tek | _ | |
| Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 S | Leica Biosystems | _ | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | D-8418 | Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles. |
| Dry ice container (styrofoam cooler) | Novolab | A26742 | |
| Dumont forceps | Fine Science Tools, Germany | 11295-10 | |
| Glass Petri dish (H 25 mm, ø 150 mm) |
Thermo Scientific | 150318 | Used to weigh the liver after dissection |
| Glycergel | DAKO Omnis | S303023 | |
| GraphPad Prism software, version 9.3.1 | GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA | ||
| High-fat diet | Envigo, Barcelona, Spain | MD.08811 | |
| Ketamine (Nimatek 100 mg/mL) | Dechra | 791/01/14DFVPT | Used at a final concentration of 75 mg/kg |
| Laser scanning confocal microscope (QUASAR detection unit; ) | Carl Zeiss, germany | LSM 710 Axio Observer Z1 microscope | |
| Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) | Dechra | 1838 ESP / 020/01/07RFVPT | Used at a final concentration of 1 mg/kg |
| Needle | BD microlance | 300635 | |
| No 15 Sterile carbon steel scalpel Blade |
Swann-Morton | 205 | |
| Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil) | Carl Zeiss, Germany | ||
| Paint brushes | Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X | Used to handle cryosections | |
| Peristaltic pump (Minipuls 3) | Gilson | 1004170 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | P3813 | |
| Scalpel handle, 125 mm (5"), No. 3 | Swann-Morton | 0208 | |
| Slide staining system StainTray | Simport Scientific | M920 | |
| Standard diet | Mucedola | 4RF21 | |
| Superfrost Plus microscope slides | Menzel-Glaser, Germany | J1800AMNZ | |
| Tissue-Tek OCT mounting media | VWR CHEMICALS | 361603E | |
| Triglycerides colorimetric assay kit | Cayman Chemical | 10010303 | |
| Ultrasonic bath | Bandelin Sonorex | TK 52 | |
| Vannas spring scissors - 3 mm cutting edge |
Fine Science Tools, Germany | 15000-00 | |
| ZEN Black software | Zeiss |
References
- Klemm, R. W., Ikonen, E. The cell biology of lipid droplets: More than just a phase. Seminars in Cell & Developmental Biology. 108, 1-3 (2020).
- Martin, S., Parton, R. G. Lipid droplets: A unified view of a dynamic organelle. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (5), 373-378 (2006).
- Thiele, C., Penno, A. Lipid droplets. Encyclopedia of Cell Biology. Bradshaw, R. A., Stahl, P. D. , Academic Press. Cambridge, MA. 273-278 (2016).
- Gluchowski, N. L., Becuwe, M., Walther, T. C., Farese, R. V. Lipid droplets and liver disease: From basic biology to clinical implications. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (6), 343-355 (2017).
- Bickel, P. E., Tansey, J. T., Welte, M. A. PAT proteins, an ancient family of lipid droplet proteins that regulate cellular lipid stores. Biochimica et Biophysica Acta. 1791 (6), 419-440 (2009).
- Olzmann, J. A., Carvalho, P. Dynamics and functions of lipid droplets. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).
- Wang, L., Liu, J., Miao, Z., Pan, Q., Cao, W. Lipid droplets and their interactions with other organelles in liver diseases. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 133, 105937 (2021).
- Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
- Jackson, C. L.
- Onal, G., Kutlu, O., Gozuacik, D., Dokmeci Emre, S. Lipid droplets in health and disease. Lipids in Health and Disease. 16 (1), 128 (2017).
- Wang, H., Quiroga, A. D., Lehner, R. Lipid Droplets. Methods in Cell Biology. Yang, H., Li, P. , Academic Press. Cambridge, MA. 107-127 (2013).
- Listenberger, L. L., Brown, D. A. Fluorescent detection of lipid droplets and associated proteins. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 24, Unit 24.2 (2007).
- Welte, M. A., Gould, A. P. Lipid droplet functions beyond energy storage. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), 1260-1272 (2017).
- Roberts, M. A., Olzmann, J. A. Protein quality control and lipid droplet metabolism). Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 115-139 (2020).
- Filali-Mouncef, Y., et al. The ménage à trois of autophagy, lipid droplets and liver disease. Autophagy. 18 (1), 50-72 (2022).
- Bandyopadhyay, D., et al. Lipid droplets promote phase separation of Ago2 to accelerate Dicer1 loss and decelerate miRNA activity in lipid exposed hepatic cells. bioRxiv. , (2020).
- Farías, M. A., Diethelm-Varela, B., Navarro, A. J., Kalergis, A. M., González, P. A. Interplay between lipid metabolism, lipid droplets, and DNA virus infections. Cells. 11 (14), 2224 (2022).
- Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: Lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
- Greenberg, A. S., et al. The role of lipid droplets in metabolic disease in rodents and humans. The Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2102-2110 (2011).
- Xu, S., Zhang, X., Liu, P. Lipid droplet proteins and metabolic diseases. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864 (5), 1968-1983 (2018).
- Herms, A., et al. Cell-to-cell heterogeneity in lipid droplets suggests a mechanism to reduce lipotoxicity. Current Biology. 23 (15), 1489-1496 (2013).
- Hooper, A. J., Adams, L. A., Burnett, J. R. Genetic determinants of hepatic steatosis in man. Journal of Lipid Research. 52 (4), 593-617 (2011).
- Parafati, M., Kirby, R. J., Khorasanizadeh, S., Rastinejad, F., Malany, S. A nonalcoholic fatty liver disease model in human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes, created by endoplasmic reticulum stress-induced steatosis. Disease Models & Mechanisms. 11 (9), (2018).
- Nassir, F., Rector, R. S., Hammoud, G. M., Ibdah, J. A. Pathogenesis and prevention of hepatic steatosis. Gastroenterology & Hepatology. 11 (3), 167-175 (2015).
- Starekova, J., Reeder, S. B. Liver fat quantification: Where do we stand. Abdominal Radiology. 45 (11), 3386-3399 (2020).
- Fabbrini, E., Sullivan, S., Klein, S. Obesity and nonalcoholic fatty liver disease: Biochemical, metabolic, and clinical implications. Hepatology. 51 (2), 679-689 (2010).
- Kristiansen, M. N. B., Veidal, S. S., Christoffersen, C., Jelsing, J., Rigbolt, K. T. G. Molecular characterization of microvesicular and macrovesicular steatosis shows widespread differences in metabolic pathways. Lipids. 54 (1), 109-115 (2019).
- Tsutsumi, V., Nakamura, T., Ueno, T., Torimura, T., Aguirre-García, J. Chapter 2: Structure and ultrastructure of the normal and diseased liver. Liver Pathophysiology. Muriel, P. , Academic Press. Cambridge, MA. 23-44 (2017).
- Tandra, S., et al. Presence and significance of microvesicular steatosis in nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Hepatology. 55 (3), 654-659 (2011).
- Nascimbeni, F., et al. Clinical relevance of liver histopathology and different histological classifications of NASH in adults. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 12 (4), 351-367 (2018).
- Yerian, L. Histopathological evaluation of fatty and alcoholic liver diseases. Journal of Digestive Diseases. 12 (1), 17-24 (2011).
- Stöppeler, S., et al. Gender and strain-specific differences in the development of steatosis in rats. Laboratory Animals. 47 (1), 43-52 (2013).
- Hübscher, S. G. Alcohol-induced liver disease. Practical Hepatic Pathology: A Diagnostic Approach (Second Edition). Saxena, R. , Elsevier. Amsterdam, the Netherlands. 371-390 (2018).
- Sethunath, D., et al. Automated assessment of steatosis in murine fatty liver. PLoS One. 13 (5), e0197242 (2018).
- Sinton, M. C., et al. Macrovesicular steatosis in nonalcoholic fatty liver disease is a consequence of purine nucleotide cycle driven fumarate accumulation. bioRxiv. , (2020).
- de Conti, A., et al. Characterization of the variability in the extent of nonalcoholic fatty liver induced by a high-fat diet in the genetically diverse collaborative cross mouse model. The FASEB Journal. 34 (6), 7773-7785 (2020).
- Virarkar, M., Szklaruk, J., Jensen, C. T., Taggart, M. W., Bhosale, P.
- Le, T. T., Ziemba, A., Urasaki, Y., Brotman, S., Pizzorno, G. Label-free evaluation of hepatic microvesicular steatosis with multimodal coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. PLoS One. 7 (11), e51092 (2012).
- Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets. Materials. 11 (9), 1768 (2018).
- Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8 (1), 42 (2015).
- Daemen, S., van Zandvoort, M. A. M. J., Parekh, S. H., Hesselink, M. K. C. Microscopy tools for the investigation of intracellular lipid storage and dynamics. Molecular Metabolism. 5 (3), 153-163 (2015).
- Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 598358 (2011).
- Prats, C., et al. An optimized histochemical method to assess skeletal muscle glycogen and lipid stores reveals two metabolically distinct populations of type I muscle fibers. PLoS One. 8 (10), e77774 (2013).
- Nakano, T., et al. Ezetimibe impairs transcellular lipid trafficking and induces large lipid droplet formation in intestinal absorptive epithelial cells. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1865 (12), 158808 (2020).
- Adomshick, V., Pu, Y., Veiga-Lopez, A. Automated lipid droplet quantification system for phenotypic analysis of adipocytes using CellProfiler. Toxicology Mechanisms and Methods. 30 (5), 378-387 (2020).
- Moon, J., et al. Intravital longitudinal imaging of hepatic lipid droplet accumulation in a murine model for nonalcoholic fatty liver disease. Biomedical Optics Express. 11 (9), 5132-5146 (2020).
- Martinez-Lopez, N., Singh, R. Autophagy and lipid droplets in the liver. Annual Review of Nutrition. 35, 215-237 (2015).
- Collot, M., et al. Ultrabright and fluorogenic probes for multicolor imaging and tracking of lipid droplets in cells and tissues. Journal of the American Chemical Society. 140 (16), 5401-5411 (2018).
- Selvais, C. M., De Cock, L. L., Brichard, S. M., Davis-Lopez de Carrizosa, M. A. Fiber type and subcellular-specific analysis of lipid droplet content in skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: Jove. (184), e63718 (2022).
- Zhuang, H., et al. Long-term high-fat diet consumption by mice throughout adulthood induces neurobehavioral alterations and hippocampal neuronal remodeling accompanied by augmented microglial lipid accumulation. Brain, Behavior, and Immunity. 100, 155-171 (2022).
- Chen, J., Yue, F., Kuang, S. Labeling and analyzing lipid droplets in mouse muscle stem cells. STAR Protocols. 3 (4), 101849 (2022).
