Methanolbaseret helmonteret forberedelse til undersøgelse af retinale ganglionceller

Summary

Methanol kan anvendes som et ekstra fast medium til retinale helmonterede præparater og langtidsopbevaring, hvilket er nyttigt til undersøgelse af retinale ganglionceller.

Abstract

Retinale ganglionceller (RGC’er), som er projektionsneuroner i nethinden, formerer ekstern visuel information til hjernen. Patologiske ændringer i RGC’er har et tæt forhold til adskillige retinale degenerative sygdomme. Helmonteret retinal immunfarvning anvendes ofte i eksperimentelle undersøgelser af RGC’er til evaluering af udviklingsmæssige og patologiske tilstande i nethinden. Under nogle omstændigheder kan det være nødvendigt at opbevare nogle værdifulde nethindeprøver, såsom dem fra transgene mus, i lang tid uden at påvirke morfologien eller antallet af RGC’er. For troværdige og reproducerbare eksperimentelle resultater er det vigtigt at bruge et effektivt konserveringsmedium. Her beskriver vi effekten af methanol som et ekstra fast medium til retinale helmonterede præparater og langtidsopbevaring. Kort sagt, under isolationsprocessen pipetteres kold methanol (-20 ° C) på overfladen af nethinden for at hjælpe med at fikse vævene og lette deres permeabilitet, og derefter kan nethinden opbevares i kold methanol (-20 ° C), før de bliver immunfarvede. Denne protokol beskriver retina-isolationsarbejdsgangen og vævsprøvelagringsprotokollen, som er nyttig og praktisk til undersøgelse af RGC’er.

Introduction

Retinale ganglionceller (RGC’er) er de eneste projektionsneuroner i nethinden, og de integrerer og transmitterer ekstern visuel information til hjernen¹. Mange neurodegenerative sygdomme såsom glaukom og traumatisk optisk neuropati er karakteriseret ved irreversibel skade og tab af RGC’er ^2,3. Analyse af de morfologiske og kvantitative ændringer af RGC’er er et afgørende skridt i bestemmelsen af, hvordan neurodegenerative sygdomme udvikler sig og fremmer ^4,5.

Indirekte immunofluorescensanalyse er en bredt accepteret metode til overvågning af fordelingen af proteiner og celletælling. I laboratoriet anvendes helmonteret retinal immunfarvning almindeligvis i eksperimentelle undersøgelser af RGC’er for at evaluere de fysiologiske og patologiske tilstande i nethinden⁶. De mest almindelige markører, der anvendes til RGC-kvantificering i hele nethinden, inkluderer Brn3a, RNA-bindende protein med multipel splejsning (RBPMS) og så videre ^7,8. Karakterisering af mængden og fordelingen af RGC’er kræver højkvalitets helmonteret retinal immunfarvning. Generelt er nethinden i immunfarvningsprotokoller nedsænket i kemiske fikseringsmidler, før den inkuberes i antistoffer. Ideelle fikseringsmidler bør ikke ændre cellernes form, epitopernes tilgængelighed eller affinitet for antistoffer eller vævets lineære dimensioner ^9,10.

På grund af den komplekse struktur af nethinden er problemer som retinal skrøbelighed og foldning samt nogle almindelige vanskeligheder, herunder cellekrympning og uklare kerner, tilbøjelige til at opstå, når man laver en helmonteret retinal patch, hvilket har en negativ indvirkning på eksperimentel forskning. Derudover er ikke alle nethinden immunfarvede med det samme, især når det kommer til nethinden hos transgene mus med dyre priser, der er af dyrebar oprindelse, hvilket nødvendiggør bevarelse af de ekstra retinale prøver til videre brug.

Den passende fikseringsopløsning kan fiksere vævet hurtigt, undgå vævsautolyse, bevare vævscellernes normale morfologi og struktur og bevare antigeniciteten af proteiner og andre stoffer¹⁰. På nuværende tidspunkt er formaldehydbaseret fiksering blevet anvendt i vid udstrækning i forskellige væv, herunder adskilte nethinder, halverede øjenkopper og hele øjenkugler¹⁰. Vævssvind og den morfologiske ændring af celler er de to kritiske udfordringer, der opstår efter nedsænkning i formaldehyd¹¹. Derudover dukker modificerede fikseringsformuleringer i stigende grad op for at maksimere tilbageholdelsen af de oprindelige egenskaber af nethinden og målcellerne ^9,10. Forskellige retinale fikseringsbehandlinger kan påvirke retinal struktur, proteinimmunogenicitet, fluorescensexcitation og dæmpningsslukningscyklus forskelligt^12,13. Nethinder, der er fikseret med Davidsons opløsning, er mere morfologisk intakte sammenlignet med dem, der er fastgjort med formalin, men Davidsons opløsning er mindre kompatibel med nogle antistoffer, såsom mikroglial markør-ioniseret calciumbindingsadaptermolekyle 1¹². I betragtning af nethindernes skrøbelige natur vil forskere naturligvis undre sig over, om retinal integritet såvel som målcellernes egenskaber og morfologi vil ændre sig efter langvarig opbevaring. Imidlertid er de mulige virkninger af fikseringsopløsning på retinal og RGC-cellemorfologi efter opbevaring i flere måneder sjældent blevet rapporteret. Optimering af retinal fiksering er afgørende for evaluering og bevarelse af RGC’er.

Vi giver en detaljeret beskrivelse af en pålidelig og teknisk ligetil metode, som vi bruger til helmonteret murin retinal farvning. Vores metode lægger vægt på korrekt forberedelse og opbevaring af nethinden til RGC-undersøgelse under hensyntagen til behovet for langtidsopbevaring af nethindevæv samt specifikke aspekter af fluorofordannelse eller nedbrydning.

Protocol

Alle trin udføres ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet. Alle anvendte C57BL/6J-mus blev fremstillet af Laboratory Animal Center ved Wuhan Universitet, og alle relaterede forsøg blev godkendt af Committee on the Ethics of Animal Experiments ved Wuhan University. Alle bestræbelser blev gjort for at minimere musenes lidelse. 1. Enucleation og fiksering af øjnene Aflive musene med kuldioxidkvælning, og enukleer øjeæblet forsigtigt ved hjælp af tandløs …

Representative Results

Efter dissektion skal nethinden ligne en flad firkløver. I denne undersøgelse, ved hjælp af protokollen skitseret ovenfor, blev nethinden hvid efter tilsætning af methanol (figur 1). I mellemtiden ændrede nethinden sig fra blød til bøjelig og flad. Dernæst blev RGC’erne mærket med anti-RBPMS8. Fire billedfelter blev taget i helmonteret nethinden (n = 3) ved hjælp af et konfokalmikroskop (okular: 10x; mål: 40x). Repræsentative visninger af visualiserede RGC…

Discussion

Fiksering er et vigtigt skridt for at bevare nethinden, hvilket kan påvirke eventuelle efterfølgende RGC-undersøgelser baseret på morfologi. Vellykket fiksering fanger hurtigt nethinden struktur og tilstand i det øjeblik, de udsættes for fikseringsmediet, hvilket er afgørende for yderligere analyse. Selvom formaldehyd er blevet betragtet som et af de mest almindelige fikseringsmidler til vævs- og cellefiksering og konservering, fungerer formaldehyd alene ikke altid godt som det optimale kemiske fikseringsmiddel t…

Materials

24-well cell culture cluster	Costar		Eyeball fixation
24-well hemagglutination plate	Labedit Company		Incubation antibody
Adhesion microscope slides	Citotest		Or similar
Anti-fluorescent quenching mountant	Servicebio	G1401	Slow down fluorescence quenching
BSA (bovine serum albumin)	Servicebio	GC305010	Blocking reagent
Confocal microscope	OLYMPUS		Apply 40x objective lens
Curved scissors	Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.		Dissecting tools
Dissecting microscope	RWD Life science Co.,LTD	77001S	Dissecting tools
Forceps	Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.		Dissecting tools
Methanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	20210624	GC≥99.5%
Nail polish	SecheVite		Sealing agent
Needles	Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd.		Accelerate the fixation
Paraformaldehyde solution	Servicebio	G1101	Eyeball fixation
PBS (phosphate buffered saline pH 7.4)	Servicebio	G0002	Rinse the eyeball
Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS)	PhosphoSolutions	Cat. #1832-RBPMS	For immunofluorescence. Used at 1:400
Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	706-165-148	For immunofluorescence. Used at 1:400
Straight scissors	Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.		Dissecting tools