Summary

Preparação de montagem inteira à base de metanol para a investigação de células ganglionares da retina

Published: April 07, 2023
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Summary

O metanol pode ser usado como um meio fixo auxiliar para preparações retinianas de montagem completa e armazenamento a longo prazo, o que é útil para a investigação de células ganglionares da retina.

Abstract

As células ganglionares da retina (RGCs), que são os neurônios de projeção da retina, propagam informações visuais externas para o cérebro. As alterações patológicas nos CGRs têm estreita relação com inúmeras doenças degenerativas da retina. A imunomarcação retiniana de montagem total é frequentemente usada em estudos experimentais em CGRs para avaliar as condições de desenvolvimento e patologias da retina. Em algumas circunstâncias, algumas amostras valiosas de retina, como as de camundongos transgênicos, podem precisar ser retidas por um longo período sem afetar a morfologia ou o número de RGCs. Para resultados experimentais confiáveis e reprodutíveis, o uso de um meio de preservação eficaz é essencial. Aqui, descrevemos o efeito do metanol como um meio fixo auxiliar para preparações retinianas de montagem completa e armazenamento a longo prazo. Em resumo, durante o processo de isolamento, o metanol frio (-20 °C) é pipetado na superfície da retina para ajudar a fixar os tecidos e facilitar sua permeabilidade, e então as retinas podem ser armazenadas em metanol frio (-20 °C) antes de serem imunomarcadas. Este protocolo descreve o fluxo de trabalho de isolamento da retina e o protocolo de armazenamento de amostras de tecido, que é útil e prático para a investigação de CGRs.

Introduction

As células ganglionares da retina (CGRs) são os únicos neurônios de projeção na retina, integrando-se e transmitindo informações visuais externas ao cérebro1. Muitas doenças neurodegenerativas, como o glaucoma e a neuropatia óptica traumática, são caracterizadas por danos irreversíveis e perda deCGRs 2,3. Analisar as alterações morfológicas e quantitativas dos CGRs é um passo crucial para determinar como as doenças neurodegenerativas se desenvolvem e avançam 4,5.

O ensaio de imunofluorescência indireta é um método amplamente aceito para monitorar a distribuição de proteínas e contagem celular. Em laboratório, a imunomarcação retiniana de montagem total é comumente utilizada em estudos experimentais em CGRs para avaliar as condições fisiológicas e patológicas daretina6. Os marcadores mais comuns utilizados para quantificação de RGC em toda a retina incluem Brn3a, RNA binding protein with multiple splicing (RBPMS), e assim por diante 7,8. A caracterização da quantidade e distribuição dos RGCs requer imunomarcação retiniana de alta qualidade em toda a montagem. Geralmente, nos protocolos de imunomarcação, a retina é imersa em fixadores químicos antes de ser incubada em anticorpos. Os fixadores ideais não devem alterar a forma das células, a acessibilidade ou afinidade dos epítopos por anticorpos ou as dimensões lineares do tecido 9,10.

Devido à estrutura complexa da retina, problemas como fragilidade e dobramento da retina, bem como algumas dificuldades comuns, incluindo encolhimento celular e núcleos obscuros, são propensos a ocorrer ao fazer um adesivo de retina de montagem inteira, o que tem um impacto negativo na pesquisa experimental. Além disso, nem todas as retinas são imunomarcadas imediatamente, especialmente quando se trata de retinas de camundongos transgênicos com preços caros e de origem preciosa, exigindo a preservação das amostras extras de retina para uso posterior.

A solução fixadora apropriada pode fixar o tecido rapidamente, evitar a autólise tecidual, preservar a morfologia e a estrutura normais das células teciduais e manter a antigenicidade de proteínas e outras substâncias10. Atualmente, a fixação à base de formaldeído tem sido amplamente utilizada em vários tecidos, incluindo retinas separadas, copos hemisseccionados e globos oculares inteiros10. A retração tecidual e a alteração morfológica das células são os dois desafios críticos encontrados após a imersão em formaldeído11. Além disso, formulações de fixação modificadas estão surgindo cada vez mais para maximizar a retenção das propriedades originais da retina e das células-alvo 9,10. Diferentes tratamentos de fixação retiniana podem afetar a estrutura retiniana, a imunogenicidade de proteínas, a excitação da fluorescência e o ciclo de têmpera da atenuação de forma diferente12,13. As retinas fixadas com solução de Davidson são morfologicamente mais intactas quando comparadas àquelas fixadas com formalina, mas a solução de Davidson é menos compatível com alguns anticorpos, como a molécula adaptadora de ligação de cálcio ionizada a marcadores microgliais 112. Considerando a natureza frágil das retinas, os pesquisadores naturalmente se perguntariam se a integridade da retina, bem como as propriedades e a morfologia das células-alvo, mudarão após o armazenamento de longo prazo. No entanto, os possíveis efeitos da solução de fixação na morfologia das células retinianas e RGC após o armazenamento por vários meses foram raramente relatados. A otimização da fixação retiniana é fundamental para a avaliação e preservação dos CGRs.

Fornecemos uma descrição detalhada de um método confiável e tecnicamente simples que usamos para coloração de retina murina de montagem total. Nosso método enfatiza o preparo e armazenamento adequado de retinas para investigação de CGR, levando em consideração a necessidade de armazenamento em longo prazo do tecido retiniano, bem como aspectos específicos da formação ou degradação de fluoróforos.

Protocol

Todas as etapas são realizadas à temperatura ambiente, salvo indicação em contrário. Todos os camundongos C57BL/6J utilizados foram obtidos do Centro de Animais de Laboratório da Universidade de Wuhan, e todos os experimentos relacionados foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentos com Animais da Universidade de Wuhan. Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento dos camundongos. 1. Enucleação e fixação dos olhos Eutanasiar os camu…

Representative Results

Após a dissecção, a retina deve parecer um trevo plano de quatro folhas. Neste estudo, utilizando o protocolo descrito acima, a retina ficou branca após a adição de metanol (Figura 1). Enquanto isso, a retina mudou de macia para maleável e plana. Em seguida, os CGRs foram marcados com anti-RBPMS8. Quatro campos de imagem foram obtidos na retina de montagem total (n = 3) usando um microscópio confocal (ocular: 10x; objetivo: 40x). Visões representativas dos CG…

Discussion

A fixação é um passo essencial para preservar a retina, o que pode interferir em investigações subsequentes do CGR com base na morfologia. A fixação bem-sucedida captura rapidamente a estrutura e o estado das retinas no momento de expô-las ao meio de fixação, o que é fundamental para uma análise mais aprofundada. Embora o formaldeído tenha sido considerado um dos agentes fixadores mais comuns para fixação e preservação de tecidos e células, o formaldeído isoladamente nem sempre funciona bem como o fixa…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pelo Projeto de Abertura dos Laboratórios Chave de Hubei (bolsa nº 2021KFY055), Fundação de Ciências Naturais da Província de Hubei (bolsa nº 2020CFB240) e Fundos de Pesquisa Fundamental para as Universidades Centrais (bolsa nº 2042020kf0065).

Materials

24-well cell culture cluster Costar Eyeball fixation
24-well hemagglutination plate Labedit Company Incubation antibody
Adhesion microscope slides Citotest Or similar
Anti-fluorescent quenching mountant Servicebio G1401 Slow down fluorescence quenching
BSA (bovine serum albumin) Servicebio GC305010 Blocking reagent
Confocal microscope OLYMPUS Apply 40x objective lens
Curved scissors Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. Dissecting tools
Dissecting microscope RWD Life science Co.,LTD  77001S Dissecting tools
Forceps Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. Dissecting tools
Methanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 20210624 GC≥99.5%
Nail polish SecheVite Sealing agent
Needles  Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd. Accelerate the fixation
Paraformaldehyde solution Servicebio G1101 Eyeball fixation
PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) Servicebio G0002 Rinse the eyeball 
Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS) PhosphoSolutions Cat. #1832-RBPMS For immunofluorescence. Used at 1:400
Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 706-165-148 For immunofluorescence. Used at 1:400
Straight scissors Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. Dissecting tools

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Cite This Article
Zhang, N., Wang, Z., Lin, P., Xing, Y., Yang, N. Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells. J. Vis. Exp. (194), e65222, doi:10.3791/65222 (2023).

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