網膜神経節細胞の研究のためのメタノールベースのホールマウント調製
Summary
メタノールは、網膜ホールマウント製剤および長期保存のための補助固定培地として使用することができ、網膜神経節細胞の調査に有用である。
Abstract
網膜の投射ニューロンである網膜神経節細胞(RGC)は、外部の視覚情報を脳に伝播します。RGCの病理学的変化は、多くの網膜変性疾患と密接な関係があります。全マウント網膜免疫染色は、網膜の発生および病理学的状態を評価するためのRGCの実験的研究で頻繁に使用されます。状況によっては、トランスジェニックマウスからのものなど、いくつかの貴重な網膜サンプルを、RGCの形態や数に影響を与えずに長期間保持する必要がある場合があります。信頼できる再現性のある実験結果を得るには、効果的な保存培地の使用が不可欠です。ここでは、網膜ホールマウント製剤および長期保存のための補助固定培地としてのメタノールの効果について述べる。簡単に言うと、単離プロセス中に、冷たいメタノール(-20°C)を網膜の表面にピペットで移して組織を固定し、その透過性を促進し、免疫染色する前に網膜を冷メタノール(-20°C)に保存することができます。このプロトコルは、網膜分離ワークフローと組織サンプル保存プロトコルを記述しており、RGCの調査に有用で実用的です。
Introduction
網膜神経節細胞(RGC)は網膜内の唯一の投射ニューロンであり、外部の視覚情報を統合して脳に伝達します1。緑内障や外傷性視神経障害などの多くの神経変性疾患は、不可逆的な損傷とRGCの喪失を特徴としています2,3。RGCの形態学的および量的変化を分析することは、神経変性疾患がどのように発症し進行するかを決定する上で重要なステップです4,5。
間接免疫蛍光アッセイは、タンパク質の分布と細胞カウントをモニターするために広く受け入れられている方法です。実験室では、網膜の生理学的および病理学的状態を評価するために、RGCの実験的研究で全マウント網膜免疫染色が一般的に使用されています6。網膜全体でRGC定量に使用される最も一般的なマーカーには、Brn3a、多重スプライシングを伴うRNA結合タンパク質(RBPMS)などがあります7,8。RGCの量と分布を特徴付けるには、高品質の全マウント網膜免疫染色が必要です。一般に、免疫染色プロトコルでは、網膜は抗体でインキュベートされる前に化学固定液に浸されます。理想的な固定剤は、細胞の形状、抗体に対するエピトープの接近性または親和性、または組織の直線寸法を変えるべきではない9、10。
網膜の構造が複雑なため、網膜膜の損傷や折り畳みなどの問題や、細胞の収縮や核の不明瞭さなどの一般的な問題が発生しやすく、実験研究に悪影響を及ぼします。さらに、すべての網膜がすぐに免疫染色されるわけではなく、特に貴重な起源の高価な価格のトランスジェニックマウスの網膜に関しては、さらなる使用のために余分な網膜サンプルを保存する必要があります。
適切な固定液は、組織を迅速に固定し、組織の自己消化を回避し、組織細胞の正常な形態と構造を維持し、タンパク質やその他の物質の抗原性を維持することができます10。現在、ホルムアルデヒドベースの固定は、分離された網膜、半切除されたアイカップ、および眼球全体を含む様々な組織において広く使用されている10。組織の収縮と細胞の形態学的変化は、ホルムアルデヒド11に浸した後に直面する2つの重要な課題です。加えて、網膜および標的細胞の本来の特性の保持を最大化するために、修正された固定製剤がますます出現している9、10。異なる網膜固定治療は、網膜構造、タンパク質免疫原性、蛍光励起、および減弱消光サイクルに異なる影響を与える可能性があります12,13。デビッドソンの溶液で固定された網膜は、ホルマリンで固定されたものと比較して形態学的に無傷ですが、デビッドソンの溶液は、ミクログリアマーカーイオン化カルシウム結合アダプター分子112などの一部の抗体との適合性が低くなります。網膜の脆弱な性質を考えると、研究者は当然、網膜の完全性、ならびに標的細胞の特性と形態が長期保存後に変化するかどうか疑問に思うでしょう。しかし、数ヶ月保存後の網膜およびRGC細胞の形態に対する固定液の影響の可能性はほとんど報告されていません。網膜固定の最適化は、RGCの評価と保存に不可欠です。
全マウントマウス網膜染色に使用する信頼性が高く技術的に簡単な方法の詳細な説明を提供します。私たちの方法は、網膜組織の長期保存の必要性と蛍光色素の形成または分解の特定の側面を考慮して、RGC調査のための網膜の適切な調製と保存を強調しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
固定は網膜を保存するための重要なステップであり、形態に基づくその後のRGC調査に影響を与える可能性があります。固定が成功すると、網膜を固定媒体にさらした瞬間の網膜の構造と状態が迅速にキャプチャされ、これはさらなる分析にとって重要です。ホルムアルデヒドは、組織および細胞の固定および保存のための最も一般的な固定剤の1つと見なされてきましたが、ホルムアルデヒド…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、湖北省重点研究所開設プロジェクト(助成金番号2021KFY055)、湖北省自然科学財団(助成金番号2020CFB240)、および中央大学の基礎研究資金(助成金番号2042020kf0065)から資金提供を受けました。
Materials
| 24-well cell culture cluster | Costar | Eyeball fixation | |
| 24-well hemagglutination plate | Labedit Company | Incubation antibody | |
| Adhesion microscope slides | Citotest | Or similar | |
| Anti-fluorescent quenching mountant | Servicebio | G1401 | Slow down fluorescence quenching |
| BSA (bovine serum albumin) | Servicebio | GC305010 | Blocking reagent |
| Confocal microscope | OLYMPUS | Apply 40x objective lens | |
| Curved scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Dissecting microscope | RWD Life science Co.,LTD | 77001S | Dissecting tools |
| Forceps | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 20210624 | GC≥99.5% |
| Nail polish | SecheVite | Sealing agent | |
| Needles | Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd. | Accelerate the fixation | |
| Paraformaldehyde solution | Servicebio | G1101 | Eyeball fixation |
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Servicebio | G0002 | Rinse the eyeball |
| Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS) | PhosphoSolutions | Cat. #1832-RBPMS | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-165-148 | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Straight scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools |
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