Síntesis directa de nanopartículas de oro EM-visibles en células para análisis de localización de proteínas con ultraestructura bien conservada
Summary
El presente protocolo describe una tecnología de etiquetado de microscopía electrónica clonable para detectar proteínas marcadas con metalotioneína en células utilizando una nueva técnica de síntesis de nanopartículas de oro basada en el mecanismo de supresión de autonucleación.
Abstract
El análisis de la localización precisa de moléculas de proteínas en células con resolución ultraestructural es de gran importancia para el estudio de diversos procesos fisiológicos o patológicos en todos los organismos vivos. Por lo tanto, el desarrollo de etiquetas clonables que se pueden utilizar como sondas de microscopía electrónica es de gran valor, al igual que las proteínas fluorescentes han jugado un papel crucial en el campo de la imagen óptica. Recientemente se descubrió el mecanismo de supresión de autonucleación (ANSM), que permite la síntesis específica de nanopartículas de oro (AuNP) en etiquetas ricas en cisteína, como la metalotioneína (MT) y la proteína anticongelante (AFP).
Basado en el ANSM, se desarrolló una tecnología de etiquetado por microscopía electrónica, que permite la detección específica de proteínas marcadas en células procariotas y eucariotas con una eficiencia de etiquetado sin precedentes. Este estudio ilustra un protocolo para la detección de proteínas de fusión MTn (una variante de MT diseñada que carece de residuos reactivos al aldehído) en células de mamíferos con una ultraestructura bien conservada. En este protocolo, la congelación a alta presión y la fijación por congelación y sustitución por congelación se realizaron utilizando fijadores no aldehídos (como ácido tánico, acetato de uranilo) para preservar la ultraestructura casi nativa y evitar daños a la actividad de la etiqueta causada por la reticulación de aldehído.
Se utilizó una simple rehidratación de un solo paso antes de la síntesis de AuNP basada en ANSM. Los resultados mostraron que las proteínas marcadas se dirigieron a varios orgánulos, incluidas las membranas y la luz del retículo endoplásmico (RE), y las matrices mitocondriales se detectaron con alta eficiencia y especificidad. Esta investigación proporciona a los biólogos un protocolo robusto para abordar una enorme gama de cuestiones biológicas a nivel de molécula única en contextos ultraestructurales celulares.
Introduction
En la era postgenómica, el desarrollo de la proteína fluorescente verde (GFP) como reportero de una sola molécula para microscopía óptica ha revolucionado el campo de la investigación moderna en ciencias de la vida 1,2. Durante décadas, la microscopía electrónica (EM) ha sido una herramienta poderosa para observar intuitivamente la ultraestructura celular con resolución a nanoescala3; Sin embargo, la identificación precisa y la localización de las moléculas de proteínas siguen siendo un desafío.
La técnica de marcado EM más utilizada es la técnica de marcado de microscopía inmunoelectrónica (IEM), que se basa en la reacción antígeno-anticuerpo. Sin embargo, aunque se han desarrollado muchas técnicas en el campo del etiquetado IEM, incluyendo IEM pre-incrustado y IEM post-incrustado (en secciones de resina o criosecciones hidratadas), todavía sufre de baja eficiencia de etiquetado (<10%)4,5, que está relacionado con la preparación de la muestra y la calidad de los anticuerpos. Para superar estas limitaciones, el desarrollo de etiquetas codificadas genéticamente tiene un gran potencial de aplicación.
Dos tipos principales de etiquetas EM se han explorado a fondo en los últimos años. Un tipo es el método de tinción DAB, que utiliza etiquetas como APEX2 para oxidar 3,3′-diaminobencidina (DAB) a polímeros osmiófilos para la visualización EM 6,7,8,9,10,11,12. Permite el etiquetado de proteínas de alta abundancia en regiones subcelulares, pero no es adecuado para el recuento de moléculas individuales. El otro tipo utiliza proteínas de unión a metales, como la ferritina 13 y la metalotioneína (MT)14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, para generar depósitos metálicos densos en electrones en situ para visualización EM. Solo este último tiene un potencial real para la visualización y el conteo de moléculas individuales. El tamaño molecular de la ferritina es demasiado grande (~ 450 kD) para que se use como una etiqueta prometedora, mientras que el pequeño tamaño (~ 5 kD) de MT y su capacidad para unir varios iones a través de sus 20 cisteínas han atraído gran atención. Varios laboratorios han intentado etiquetar proteínas de fusión MT purificadas o células que expresan MT incubando directamente con Au +. Estos intentos han demostrado inicialmente que las etiquetas MT pueden unirse a iones de oro para formar señales de alto contraste, pero ninguno ha logrado realmente la identificación efectiva de proteínas individuales en las células, y no son ampliamente aplicables 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.
La técnica de síntesis de AuNP basada en ANSM, que consiste en sintetizar AuNP de tamaño 2-6 nm directamente en etiquetas ricas en cisteína (por ejemplo, MT, las variantes MT MTn y MTα, AFP) como etiquetas densas en electrones para la visualización EM, es el primer enfoque confiable y aplicable para el etiquetado de proteínas y la detección de moléculas individuales en células24,25,26. Permite la síntesis específica de AuNPs en proteínas aisladas de fusión de etiquetas y ha logrado una eficiencia de etiquetado sin precedentes en células procariotas (E. coli) y eucariotas (S. pombe) no fijas o fijadas químicamente. Sin embargo, implementar el mismo protocolo en sistemas más avanzados, como células de mamíferos o incluso tejidos, implica desafíos adicionales, como la homeostasis redox intracelular más compleja y la estructura celular más frágil.
Este estudio presenta una tecnología de etiquetado EM clonable, que combina la novedosa técnica de síntesis de AuNP basada en ANSM para etiquetar etiquetas ricas en cisteína (MT) codificadas genéticamente con el método de preparación de muestras HPF / FSF -rehidratación-HPF / FSF, permite la identificación inequívoca de una sola molécula de proteínas marcadas en la membrana ER, la luz ER y la matriz mitocondrial en células HeLa. El método actual combina las características de alta eficiencia de etiquetado, una alta relación señal-ruido, etiquetado de una sola molécula y una fuerte universalidad, y este método tiene amplias perspectivas de aplicación en la investigación de ciencias de la vida.
Protocol
Representative Results
Discussion
El estudio presenta aquí una robusta tecnología de etiquetado EM clonable para la visualización de moléculas de proteínas individuales dentro del entorno celular con resolución ultraestructural. Las AuNP sintetizadas directamente en etiquetas ricas en cisteína codificadas genéticamente proporcionan una localización inequívoca y precisa de las proteínas diana. La técnica de congelación a alta presión y la sustitución por congelación preservan excelentemente la ultraestructura de las muestras biológicas. E…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El protocolo descrito aquí se derivó del artículo publicado por Jiang et al. (2020). Este trabajo fue apoyado por subvenciones de MOST (973 Programas nos. 2011CB812502 y 2014CB849902) y por el apoyo financiero del Gobierno Municipal de Beijing.
Materials
| 0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrier | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| 0.2 M HEPES buffer | Dissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5 | ||
| 1.5 mL MaxyClear snaplock microtube | Axygen Scientific | MCT150C | |
| 2 mL polypropylene screw cap microtubes | Biologix | 81-0204 | |
| 200 mesh hexagonal copper grid | Tedpella inc | G200HEX | |
| 2-mercaptoethanol | Amresco | 0482-250ML | |
| 35 mm cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430928 | |
| Acetone | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 31025 | |
| Automated freeze substitution machine | Leica | AFS2 | |
| Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPF | Beijing Wulundes Biotech Ltd. | ||
| D-penicillamine | TCI | P0147 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium | GBICO | C11965500BT | |
| Fetal bovine serum | GBICO | 10099-141C | |
| Flat bottom embedding capsule | Tedpella inc | ||
| Foam cryobox | |||
| Formvar 15/95 resin | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| HAuCl4 | Sigma | 4022-1G | |
| HEPES | sigma | H3375-500G | |
| HPF machine | Wohlwend | HPF compact01 | |
| Methonal | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 12397 | |
| NaBH4 | Sigma | 480886-25G | |
| OsO4 | Electron Microscopy Sciences | 19110 | |
| PBS-A buffer | Dissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4 | ||
| Qualitative filter paper (medium speed) | Beyotime Biotechnology | FFT08 | |
| Sapphire discs | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| Solvent resistant pen | Electron Microscopy Sciences | 62053-B | |
| SPI-Pon 812 resin | SPI Inc | 02659-AB | |
| Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 spirit | |
| Trypsin-EDTA | GBICO | C25200-056 | |
| Tweezers | Dumont | ||
| Ultramictotome | Leica | FC7 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
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