잘 보존된 미세 구조를 가진 단백질 국소화 분석을 위한 세포에서 EM-Visible Gold Nanoparticles의 직접 합성
Summary
본 프로토콜은 새로운 자가핵형성 억제 메커니즘 기반 금 나노입자 합성 기술을 사용하여 세포에서 메탈로티오네인 태그가 부착된 단백질을 검출하기 위한 클로너블 전자 현미경 표지 기술을 설명합니다.
Abstract
미세 구조적 분해능으로 세포에서 단백질 분자의 정확한 국소화를 분석하는 것은 모든 살아있는 유기체의 다양한 생리학적 또는 병리학적 과정을 연구하는 데 매우 중요합니다. 따라서 전자 현미경 프로브로 사용할 수 있는 복제 가능한 태그의 개발은 형광 단백질이 광학 이미징 분야에서 중요한 역할을 한 것처럼 큰 가치가 있습니다. 자가핵형성 억제 메커니즘(ANSM)이 최근 밝혀졌으며, 이는 메탈로티오네인(MT) 및 부동액 단백질(AFP)과 같은 시스테인이 풍부한 태그에서 금 나노입자(AuNP)의 특이적 합성을 가능하게 합니다.
ANSM을 기반으로 전자 현미경 표지 기술이 개발되어 전례 없는 표지 효율로 원핵 및 진핵 세포에서 태그가 부착된 단백질을 특이적으로 검출할 수 있습니다. 이 연구는 미세 구조가 잘 보존된 포유류 세포에서 MTn(알데히드 반응성 잔기가 없는 조작된 MT 변이체) 융합 단백질을 검출하기 위한 프로토콜을 보여줍니다. 이 프로토콜에서, 고압 동결 및 동결 치환 고정은 비-알데히드 고정제(예: 탄닌산, 우라닐 아세테이트)를 사용하여 수행되었으며, 이는 거의 천연 미세 구조를 보존하고 알데히드 가교결합으로 인한 태그 활성의 손상을 방지하였다.
ANSM계 AuNP 합성 전에 간단한 1단계 재수화를 사용하였다. 그 결과 태그된 단백질이 소포체(ER)의 막과 내강을 포함한 다양한 세포 소기관을 표적으로 삼고 미토콘드리아 매트릭스가 높은 효율과 특이성으로 검출되는 것으로 나타났습니다. 이 연구는 생물학자들에게 세포 미세 구조적 맥락에서 단일 분자 수준에서 방대한 범위의 생물학적 문제를 해결할 수 있는 강력한 프로토콜을 제공합니다.
Introduction
포스트 게놈 시대에 광학 현미경을 위한 단일 분자 리포터로서 녹색 형광 단백질(GFP)의 개발은 현대 생명 과학 연구 분야에 혁명을 일으켰습니다 1,2. 수십 년 동안 전자 현미경(EM)은 나노 해상도3으로 세포 미세 구조를 직관적으로 관찰할 수 있는 강력한 도구였습니다. 그러나 단백질 분자의 정확한 식별과 국소화는 여전히 어려운 과제입니다.
가장 일반적으로 사용되는 EM 표지 기술은 항원-항체 반응을 기반으로 하는 면역전자 현미경(IEM) 표지 기술입니다. 그러나 IEM 사전 임베딩 및 IEM 사후 임베딩(수지 절편 또는 수화 극저온 절편)을 포함하여 IEM 라벨링 분야에서 많은 기술이 개발되었지만 여전히 낮은 라벨링 효율(<10%)4,5, 이는 샘플 준비 및 항체 품질과 관련이 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 유전적으로 암호화된 태그를 개발하는 것은 큰 응용 가능성을 가지고 있습니다.
최근 몇 년 동안 두 가지 주요 유형의 EM 태그가 철저히 조사되었습니다. 한 가지 유형은 EM 시각화6,7,8,9,10,11,12를 위해 APEX2와 같은 태그를 사용하여 3,3‘-디아미노벤지딘(DAB)을 삼온성 폴리머로 산화시키는 DAB 염색 방법입니다. 세포 내 영역에서 고농도 단백질의 표지를 가능하게 하지만 단일 분자 계수에는 적합하지 않습니다. 다른 유형은 페리틴 13 및 메탈로티오네인(MT)14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26과 같은 금속 결합 단백질을 사용하여 전자 밀도가 높은 금속 침전물을 생성합니다 . EM 시각화를 위한 현장. 후자만이 단일 분자 시각화 및 계수에 대한 실질적인 잠재력을 가지고 있습니다. 페리틴의 분자 크기가 너무 커서 유망한 태그로 사용할 수 없는 반면, MT의 작은 크기(~5kD)와 20개의 시스테인을 통해 다양한 이온을 결합하는 능력은 큰 관심을 끌었습니다. 여러 실험실에서 Au+로 직접 배양하여 정제된 MT 융합 단백질 또는 MT 발현 세포에 라벨을 붙이려고 시도했습니다. 이러한 시도는 초기에 MT 태그가 금 이온과 결합하여 고대비 신호를 형성할 수 있다는 것을 증명했지만, 실제로 세포에서 개별 단백질의 효과적인 식별을 달성한 것은 없으며 널리 적용되지 않습니다 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.
EM 시각화를 위한 전자 밀도 라벨로 시스테인이 풍부한 태그(예: MT, MT 변이체 MTn 및 MTα, AFP)에서 직접 2-6nm 크기의 AuNP를 합성하는 ANSM 기반 AuNP 합성 기술은 세포에서 단백질 라벨링 및 단일 분자 검출을 위한 최초의 신뢰할 수 있고 적용 가능한 접근 방식입니다24,25,26. 분리된 태그 융합 단백질에서 AuNP의 특이적 합성을 가능하게 하고 비고정 또는 화학적으로 고정된 원핵생물(E. coli) 및 진핵생물(S. pombe) 세포에서 전례 없는 표지 효율을 달성했습니다. 그러나 포유류 세포 또는 조직과 같은 고급 시스템에서 동일한 프로토콜을 구현하려면 더 복잡한 세포 내 산화 환원 항상성 및 더 취약한 세포 구조와 같은 추가적인 문제가 필요합니다.
이 연구는 유전적으로 암호화된 시스테인이 풍부한 태그(MT)를 라벨링하기 위한 새로운 ANSM 기반 AuNP 합성 기술과 HPF/FSF-재수화-HPF/FSF 샘플 준비 방법을 결합한 클로닝 가능한 EM 라벨링 기술을 제시하여 HeLa 세포의 ER 막, ER 내강 및 미토콘드리아 매트릭스에서 태그가 지정된 단백질의 명확한 단일 분자 식별을 가능하게 합니다. 현재의 방법은 높은 표지 효율, 높은 신호 대 잡음비, 단일 분자 표지 및 강력한 보편성의 특성을 결합하고 있으며, 이 방법은 생명 과학 연구에서 광범위한 응용 전망을 가지고 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구는 여기에서 미세 구조 분해능으로 세포 환경 내에서 단백질 분자의 단일 분자 시각화를 위한 강력한 복제 가능한 EM 라벨링 기술을 제시합니다. 유전적으로 암호화된 시스테인이 풍부한 태그에서 직접 합성된 AuNP는 표적 단백질의 명확하고 정확한 국소화를 제공합니다. 고압 동결 및 동결 대체 기술은 생물학적 시료의 미세 구조를 우수하게 보존합니다. 종합하면, 여기에 제시된 클로닝 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
여기에 설명된 프로토콜은 Jiang et al. (2020). 이 작업은 MOST(973 프로그램 번호 2011CB812502 및 2014CB849902)의 보조금과 베이징 시 정부의 자금 지원으로 지원되었습니다.
Materials
| 0.025 mm/0.275 mm Aluminum carrier | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| 0.2 M HEPES buffer | Dissolve HEPES (0.2 M) in 980 mL of ddH2O, then add 10 mL of 100 mM MgCl2 and 10 mL of 100 mM CaCl2 (final concentration 1 mM), respectively, adjust pH to 5.5 | ||
| 1.5 mL MaxyClear snaplock microtube | Axygen Scientific | MCT150C | |
| 2 mL polypropylene screw cap microtubes | Biologix | 81-0204 | |
| 200 mesh hexagonal copper grid | Tedpella inc | G200HEX | |
| 2-mercaptoethanol | Amresco | 0482-250ML | |
| 35 mm cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Corning | 430928 | |
| Acetone | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 31025 | |
| Automated freeze substitution machine | Leica | AFS2 | |
| Customized 3.05 mm x 0.66 mm specimen holders for HPF | Beijing Wulundes Biotech Ltd. | ||
| D-penicillamine | TCI | P0147 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium | GBICO | C11965500BT | |
| Fetal bovine serum | GBICO | 10099-141C | |
| Flat bottom embedding capsule | Tedpella inc | ||
| Foam cryobox | |||
| Formvar 15/95 resin | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| HAuCl4 | Sigma | 4022-1G | |
| HEPES | sigma | H3375-500G | |
| HPF machine | Wohlwend | HPF compact01 | |
| Methonal | Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company | 12397 | |
| NaBH4 | Sigma | 480886-25G | |
| OsO4 | Electron Microscopy Sciences | 19110 | |
| PBS-A buffer | Dissolve NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) in 1 L of ddH2O, adjust to pH 7.4 | ||
| Qualitative filter paper (medium speed) | Beyotime Biotechnology | FFT08 | |
| Sapphire discs | Beijing Wulundes Biotech Ltd., or Engineering Office of M. Wohlwend | ||
| Solvent resistant pen | Electron Microscopy Sciences | 62053-B | |
| SPI-Pon 812 resin | SPI Inc | 02659-AB | |
| Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 spirit | |
| Trypsin-EDTA | GBICO | C25200-056 | |
| Tweezers | Dumont | ||
| Ultramictotome | Leica | FC7 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
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