छोटे आर्थ्रोपोड से हेमोलिम्फ एकत्र करने के लिए एक सटीक और मात्रात्मक विधि
Summary
हम बाद के विश्लेषण के लिए छोटे आर्थ्रोपोड से मात्रात्मक हेमोलिम्फ को कुशलतापूर्वक एकत्र करने की एक विधि का वर्णन करते हैं।
Abstract
आर्थ्रोपोड अपने हेमोलिम्फ के माध्यम से चिकित्सा और कृषि महत्व के विभिन्न प्रकार के वायरस प्रसारित करने के लिए जाने जाते हैं, जो वायरस संचरण के लिए आवश्यक है। हीमोलिम्फ संग्रह वायरस-वेक्टर इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए बुनियादी तकनीक है। यहां, हम एक शोध मॉडल के रूप में लाओडेलफैक्स स्ट्रिएटेलस (छोटे भूरे रंग के प्लांटहॉपर, एसबीपीएच) का उपयोग करके छोटे आर्थ्रोपोड्स से हेमोलिम्फ के मात्रात्मक संग्रह के लिए एक नई और सरल विधि का वर्णन करते हैं, क्योंकि यह आर्थ्रोपोड चावल पट्टी वायरस (आरएसवी) का मुख्य वेक्टर है। इस प्रोटोकॉल में, प्रक्रिया जमे हुए आर्थ्रोपोड के एक पैर को धीरे-धीरे बारीक चिमटी से काटकर और घाव से हेमोलिम्फ को दबाकर शुरू होती है। फिर, केशिका बलों के सिद्धांत के अनुसार घाव से ट्रांसड्यूटिव हेमोलिम्फ को इकट्ठा करने के लिए एक केशिका और एक पिपेट बल्ब से युक्त एक साधारण माइक्रोपिपेट का उपयोग किया जाता है। अंत में, एकत्रित हेमोलिम्फ को आगे के अध्ययन के लिए एक विशिष्ट बफर में भंग किया जा सकता है। छोटे आर्थ्रोपोड्स से हेमोलिम्फ एकत्र करने के लिए यह नई विधि अर्बोवायरस और वेक्टर-वायरस इंटरैक्शन पर आगे के शोध के लिए एक उपयोगी और कुशल उपकरण है।
Introduction
पशु और पौधों दोनों वायरस आर्थ्रोपोड द्वारा प्रेषित किए जा सकते हैं, और ये वायरस मानव स्वास्थ्य के लिए एक गंभीर खतरा पैदा करते हैं और कृषि में जबरदस्त आर्थिक नुकसान का कारण बनते हैं 1,2,3। महत्वपूर्ण रूप से, आर्थ्रोपोड हेमोलिम्फ, जो आर्थ्रोपोड में संचार प्रणाली और प्रतिरक्षा प्रणाली के एक महत्वपूर्ण तत्व के रूप में कार्य करता है, आर्बोवायरल संचरण को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। आर्थ्रोपोड आंत के माध्यम से प्राप्त वायरस को प्रतिकूल हेमोलिम्फ वातावरण 4,5,6,7 से सफलतापूर्वक बचने के बाद ही अन्य ऊतकों में ले जाया जाता है। आर्थ्रोपोड हेमोलिम्फ में वायरस के जीवनचक्र में द्रव प्लाज्मा में वायरस का अस्तित्व, हेमोसाइट में प्रवेश और अन्य ऊतकों में परिवहन शामिल है, और हेमोलिम्फ 8,9,10,11,12 में विभिन्न वायरस-वेक्टर इंटरैक्शन तंत्र होते हैं। उदाहरण के लिए, एसबीपीएच द्वारा आरएसवी का ऊर्ध्वाधर संचरण एसबीपीएच विटेलोजेनिन प्रोटीन और आरएसवी (चावल पट्टी वायरस) कैप्सिड प्रोटीन13,14 के बीच आणविक बातचीत पर निर्भर है। कुछ वायरस विशिष्ट वेक्टर कारकों 15,16,17,18 को बांधकर हेमोलिम्फ की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से बच सकते हैं। इसलिए, आर्थ्रोपोड्स के हेमोलिम्फ में वेक्टर-वायरस इंटरैक्शन की जांच करना आर्बोवायरस ट्रांसमिशन की बेहतर समझ विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है।
कुछ छोटे कीड़ों, जैसे कि प्लांटहॉपर, लीफहॉपर और कुछ मच्छरों के हेमोलिम्फ को उनके आकार के कारण इकट्ठा करना मुश्किल है। इस मुद्दे को हल करने के लिए, हेमोलिम्फ को इकट्ठा करने के लिए कई तरीके विकसित किए गए हैं, जिसमें हेमोलिम्फ के माइक्रोवॉल्यूम को निकालने के लिए सीधे कीट शरीर में एक सिरिंज सुई डालना, घाव स्थल से बारीक चिमटी के साथ एक्स्यूडेट एकत्र करना और प्रत्यक्ष सेंट्रीफ्यूजेशन शामिल है। इन विधियों ने हेमोलिम्फ 19,20,21 के भीतर सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति स्तर और वायरल टिटर्स के माप को सक्षम किया है। हालांकि, हेमोलिम्फ मात्रा को निर्धारित करने के लिए एक प्रभावी विधि, जो हेमोसाइट गिनती, प्रोटीन परिमाणीकरण और एंजाइम गतिविधि विश्लेषण के लिए आवश्यक है, वर्तमान में इन छोटे कीड़ों के लिए उपलब्ध नहीं है।
एसबीपीएच (छोटे भूरे रंग का प्लांटहॉपर) एक प्रकार का छोटा कीट वेक्टर है जिसकी शरीर की लंबाई लगभग 2-4 मिमी है। एसबीपीएच विभिन्न प्रकार के पौधों के वायरस को प्रसारित करने में सक्षम है, जिसमें आरएसवी, मक्का रफ ड्वार्फ वायरस और चावल की काली लकीर वाला बौना वायरस22,23,24 शामिल है। एसबीपीएच और आरएसवी के बीच बातचीत का पिछले एक दशक में गहराई से अध्ययन किया गया है। एसबीपीएच के साथ काम करने की सुविधा के लिए, हमने हेमोलिम्फ एकत्र करने की एक नई और सरल विधि विकसित की। यह विधि, जो केशिका बलों के सिद्धांत पर आधारित है, एक सटीक और मात्रात्मक तरीके से कीट के हेमोलिम्फ को प्राप्त करने के लिए स्केल मार्क के साथ एक केशिका का उपयोग करती है। यह हमें छोटे कीड़ों से हेमोलिम्फ की एक विशिष्ट मात्रा को कुशलतापूर्वक एकत्र करने और छोटे वैक्टर के हेमोलिम्फ वातावरण का अधिक विस्तार से अध्ययन करने की अनुमति देता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हेमोलिम्फ आर्थ्रोपोड्स में संचार प्रणाली का माध्यम है, और आर्बोवायरस केवल अन्य आर्थ्रोपोड ऊतकों पर आक्रमण कर सकते हैं यदि वे शत्रुतापूर्ण हेमोलिम्फ वातावरण से बचने में सक्षम हैं। हेमोलिम्फ का एक उच?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान एवं विकास कार्यक्रम (संख्या 2022YFD1401700) और चीन के राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (नंबर 32090013 और नंबर 32072385) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 10% SDS-PAGE protein gel | Bio-rad | 4561035 | Protein separation and detection |
| 4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | For fixation of the cells or tissues |
| Bradford dye reagent | Bio-rad | 5000205 | Protein concentration detection |
| Capillary | Hirschmann | 9000101 | For collecting hemolymph |
| Cell counting chamber | ACMEC | AYA0810 | Hemocytes counting |
| Glass slide | Gitoglas | 10127105A | For holding insects |
| Glass slide coated with silane | Sigma | S4651-72EA | For holding microscope samples |
| Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Nucleus staining |
| Microscope cover glass | Gitoglas | 10212424C | For microscopic observation |
| Pipette bulb | Hirschmann | 9000101 | For collecting hemolymph |
| Prism 8.0 software | GraphPad Software | / | Statistical analyses |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | For insect dissection |
| Tweezers | Tianld | P5622 | For insect dissection |
| Zeiss inverted microscope | Zeiss | Observer Z1 | Hemocytes observation |
References
- Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Ray, S., Casteel, C. L. Effector-mediated plant-virus-vector interactions. Plant Cell. 34 (5), 1514-1531 (2022).
- Islam, W., et al. Plant-insect vector-virus interactions under environmental change. Science of the Total Environment. 701, 135044 (2020).
- Cory, J. S. Insect virus transmission: Different routes to persistence. Current Opinion in Insect Science. 8, 130-135 (2015).
- Wang, X. W., Blanc, S. Insect transmission of plant single-stranded DNA viruses. Annual Review of Entomology. 66, 389-405 (2021).
- Yi, H. Y., Chowdhury, M., Huang, Y. D., Yu, X. Q. Insect antimicrobial peptides and their applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (13), 5807-5822 (2014).
- Liu, W. W., et al. Proteomic analysis of interaction between a plant virus and its vector insect reveals new functions of hemipteran cuticular protein. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (8), 2229-2242 (2015).
- Wang, L., Van Meulebroek, L., Vanhaecke, L., Smagghe, G., Meeus, I. The bee hemolymph metabolome: A window into the impact of viruses on bumble bees. Viruses. 13 (4), 600 (2021).
- Jia, D., et al. Vector mediated transmission of persistently transmitted plant viruses. Current Opinion in Virology. 28, 127-132 (2018).
- Anderson, J. F., Main, A. J., Ferrandino, F. J. Horizontal and vertical transmission of West Nile Virus by Aedes vexans (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 57 (5), 1614-1618 (2020).
- Gadhave, K. R., et al. Low frequency of horizontal and vertical transmission of cucurbit leaf crumple virus in whitefly Bemisia tabaci Gennadius. Phytopathology. 110 (6), 1235-1241 (2020).
- Logan, R. A. E., et al. Vertical and horizontal transmission of cell fusing agent virus in Aedes aegypti. Applied and Environmental Microbiology. 88 (18), e0106222 (2022).
- Huo, Y., et al. Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector. PLoS Pathogens. 10 (3), e1003949 (2014).
- Wei, J., et al. Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).
- Medzhitov, R. Toll-like receptors and innate immunity. Nature Reviews Immunology. 1 (2), 135-145 (2001).
- Kingsolver, M. B., Huang, Z., Hardy, R. W. Insect antiviral innate immunity: Pathways, effectors, and connections. Journal of Molecular Biology. 425 (24), 4921-4936 (2013).
- Pei, R. J., Chen, X. W., Lu, M. J. Control of hepatitis B virus replication by interferons and Toll-like receptor signaling pathways. World Journal of Gastroenterology. 20 (33), 11618-11629 (2014).
- Kao, Y. T., Lai, M. M. C., Yu, C. Y. How dengue virus circumvents innate immunity. Frontiers in Immunology. 9, 2860 (2018).
- Gilliam, M., Shimanuki, H. Coagulation of hemolymph of the larval honey bee (Apis mellifera L). Experientia. 26 (8), 908-909 (1970).
- Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), e1006909 (2018).
- Chen, X., et al. A plant virus ensures viral stability in the hemolymph of vector insects through suppressing prophenoloxidase activation. mBio. 11 (4), e01453 (2020).
- Vidano, C. Phases of maize rough dwarf virus multiplication in the vector Laodelphax striatellus (Fallén). Virology. 41 (2), 218-232 (1970).
- Yu, Y. L., et al. Laodelphax striatellus Atg8 facilitates Rice stripe virus infection in an autophagy-independent manner. Journal of Insect Science. 28 (2), 315-329 (2021).
- Zhang, J. H., et al. Cytochrome P450 monooxygenases CYP6AY3 and CYP6CW1 regulate Rice black-streaked dwarf virus replication in Laodelphax striatellus (Fallen). Viruses. 13 (8), 1576 (2021).
- Ribeiro, C., Brehelin, M. Insect haemocytes: What type of cell is that. Journal of Insect Physiology. 52 (5), 417-429 (2006).
- Butolo, N. P., et al. A high quality method for hemolymph collection from honeybee larvae. PLoS One. 15 (6), e0234637 (2020).
- Nesa, J., et al. Antimicrobial potential of a ponericin-like peptide isolated from Bombyx mori L. hemolymph in response to Pseudomonas aeruginosa infection. Scientific Reports. 12 (1), 15493 (2022).
- Mahmoud, S., et al. Curcumin-injected Musca domestica larval hemolymph: Cecropin upregulation and potential anticancer effect. Molecules. 27 (5), 1570 (2022).
- Patton, T. G., et al. salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks. Journal of Visualized Experiments. (60), e3894 (2012).
- Piyankarage, S. C., Augustin, H., Featherstone, D. E., Shippy, S. A. Hemolymph amino acid variations following behavioral and genetic changes in individual Drosophila larvae. Amino Acids. 38 (3), 779-788 (2010).
- Fiorotti, J., et al. Disclosing hemolymph collection and inoculation of metarhizium blastospores into Rhipicephalus microplus ticks towards invertebrate pathology studies. Journal of Visualized Experiments. (148), e59899 (2019).
