Полуавтоматическое выделение стромально-васкулярной фракции из белой жировой ткани мыши с помощью тканевого диссоциатора
Summary
Этот протокол описывает полуавтоматическое выделение стромально-васкулярной фракции (SVF) из жировой ткани мыши для получения преадипоцитов и достижения дифференцировки адипоцитов in vitro. Использование тканевого диссоциатора для расщепления коллагеназы уменьшает экспериментальную изменчивость и повышает воспроизводимость.
Abstract
Исследование дифференцировки белых, коричневых и бежевых адипоцитов in vitro позволяет исследовать клеточно-автономные функции адипоцитов и их механизмы. Иммортализированные белые клеточные линии преадипоцитов находятся в открытом доступе и широко используются. Тем не менее, появление бежевых адипоцитов в белой жировой ткани в ответ на внешние сигналы трудно повторить в полной мере с использованием общедоступных клеточных линий белых адипоцитов. Выделение стромально-васкулярной фракции (SVF) из жировой ткани мыши обычно выполняется для получения первичных преадипоцитов и дифференцировки адипоцитов. Однако измельчение и переваривание жировой ткани коллагеназой вручную может привести к экспериментальным изменениям и подвержено загрязнению. Здесь мы представляем модифицированный полуавтоматический протокол, в котором используется тканевый диссоциатор для расщепления коллагеназы для достижения более легкой изоляции SVF с целью уменьшения экспериментальных вариаций, уменьшения загрязнения и повышения воспроизводимости. Полученные преадипоциты и дифференцированные адипоциты могут быть использованы для функционального и механистического анализа.
Introduction
Биология жировой ткани привлекает все большее внимание из-за растущей распространенности ожирения и диабета 2 типа во всем мире1. Адипоциты хранят избыточную энергию в виде липидных капель, которые высвобождаются при голодании. Кроме того, жировая ткань поддерживает системный энергетический гомеостаз, выступая в качестве эндокринного органа и сообщаясь с другими тканями 2,3. Интересно, что как избыток жировой ткани (ожирение), так и потеря жира (липодистрофия) связаны с резистентностью к инсулину и диабетом1. Адипоциты делятся на три типа: белые, коричневые и бежевые1. Белые адипоциты в основном хранят избыточную энергию в виде липидов, тогда как коричневые и бежевые адипоциты рассеивают энергию в виде тепла через митохондриальный разъединяющий белок-1 (Ucp1)1,4. Примечательно, что бежевые адипоциты (также называемые «индуцируемыми» коричневыми адипоцитами) появляются в белой жировой ткани в ответ на холодную или симпатическую стимуляцию и демонстрируют паттерны экспрессии генов, которые перекрываются, но отличаются от таковых у «классических» коричневых адипоцитов5. В последнее время коричневые и бежевые адипоциты стали потенциальными мишенями для лечения ожирения и диабета, направленного на «усиление рассеивания энергии», а не на «подавление потребления энергии»4. Кроме того, сообщается, что аллель риска варианта ожирения FTO rs1421085 у людей, который демонстрирует самую сильную связь с более высоким индексом массы тела (ИМТ) среди распространенных вариантов6,7 и демонстрирует различные взаимодействия генов и окружающей среды8,9, отрицательно регулирует дифференцировку и функцию бежевых адипоцитов10. Рецептор γ, активируемый пролифератором пероксисом (PPARγ), известен как главный транскрипционный регулятор адипогенеза и необходим и достаточен для дифференцировки адипоцитов11. Регуляторы транскрипции, такие как гомологичный домен PRD1-BF1-RIZ1, содержащий 16 (PRDM16), ранний фактор В-клеток 2 (EBF2) и ядерный фактор I-A (NFIA), имеют решающее значение для дифференцировки и функции адипоцитов коричневого и бежевого цвета 12,13,14,15,16,17,18. С другой стороны, программирование генов белых адипоцитов требует регуляторов транскрипции, таких как трансдуциноподобный энхансерный белок 3 (TLE3) и белок цинкового пальца 423 (ZFP423)19,20,21.
Модельные системы in vitro позволяют проводить молекулярные исследования, направленные на улучшение понимания механизма (механизмов), лежащего в основе функций и дисфункций адипоцитов. Хотя существуют общедоступные и иммортализированные клеточные линии преадипоцитов, такие как 3T3-L1 и 3T3-F442A22,23,24, культура первичных преадипоцитов и дифференцировка в адипоциты были бы более подходящей моделью для изучения адипогенеза in vivo. Выделение стромально-васкулярной фракции (СВФ) из жировой ткани мышей является известным методом получения первичных преадипоцитов25,26. Однако коллагеназное расщепление жировой ткани, которое обычно выполняется с помощью бактериального шейкера с трубчатой стойкой, может привести к экспериментальным изменениям и подвержено загрязнению27,28. Здесь мы описываем альтернативный протокол, в котором используется мягкий диссоциатор тканей с магнитно-активированной клеточной сортировкой (MACS) для расщепления коллагеназы для достижения более легкой изоляции SVF.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описали протокол выделения SVF из жировой ткани мыши для получения преадипоцитов и выполнения дифференцировки адипоцитов in vitro. Использование тканевого диссоциатора для переваривания коллагеназы уменьшило экспериментальные вариации, снизило риск загрязнения и повысило …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают благодарность Такахито Вада и Сайко Йошида (Токийский университет, Токио, Япония) за экспериментальную помощь. Эта работа финансировалась за счет следующих грантов Y.H.: исследовательский грант от Программы отличных молодых исследователей Токийского университета; Грант Японского общества содействия развитию науки (JSPS) KAKENHI для начинающих ученых, грант No 19K17976; грант для Front Runner of Future Diabetes Research (FFDR) от Японского фонда прикладной энзимологии, грант No 17F005; грант Фонда фармакологических исследований; грант Мемориального фонда медицинских и фармацевтических исследований Мочиды; грант MSD Life Science Foundation; грант от Daiwa Securities Health Foundation; грант Токийского фонда биохимических исследований; Грант на исследования в области наук о жизни от Научного фонда Такеда; и грант Фонда медицинских исследований SENSSHIN.
Materials
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 12 well plate | Corning | 3513 | |
| 60 mm dish | IWAKI | 3010-060 | |
| Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-105-808 | contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A |
| Cell strainer 70 µm | BD falcon | #352350 | |
| Collagen coated dishes, 100 mm | BD | #356450 | |
| Collagen coated dishes, 60 mm | BD | #354401 | |
| Collagen I Coat Microplate 6 well | IWAKI | 4810-010 | |
| Dexamethasone | Wako | 041-18861 | |
| Dissecting Forceps | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, blunt/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, sharp/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565-042 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | N/A | N/A | |
| gentleMACS C Tubes | Milteny Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACSOcto Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Humulin R Injection U-100 | Eli Lilly | 872492 | |
| Indomethacin | Sigma | I7378-5G | |
| Isobutylmethylxanthine (IBMX) | Sigma | 17018-1G | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Neomycin Sulfate | Fujifilm | 146-08871 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-062 | |
| pBABE-neo largeTcDNA (SV40) | Add gene | #1780 | |
| PBS tablets | Takara | T900 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | cell biolab | RV-101 | |
| Polybrene | Nacalai Tesque | 12996-81 | |
| Power Sybr Green Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | #FSQ-201 | |
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| Rosiglitazone | Wako | 180-02653 | |
| T3 | Sigma | T2877-100mg | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25200-056 |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Hotamisligil, G. S., Shargill, N. S., Spiegelman, B. M. Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: direct role in obesity-linked insulin resistance. Science. 259 (5091), 87-91 (1993).
- Zhang, Y., et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature. 372 (6505), 425-432 (1994).
- Kajimura, S., Saito, M. A new era in brown adipose tissue biology: Molecular control of brown fat development and energy homeostasis. Annual Review of Physiology. 76, 225-249 (2014).
- Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 366-376 (2012).
- Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. The genetics of obesity: from discovery to biology. Nature Reviews Genetics. 23 (2), 120-133 (2022).
- Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. The bigger picture of FTO-the first GWAS-identified obesity gene. Nature Reviews Endocrinology. 10 (1), 51-61 (2014).
- Hiraike, Y., Yang, C. T., Liu, W. J., Yamada, T., Lee, C. L. FTO obesity variant-exercise interaction on changes in body weight and BMI: The Taiwan biobank study. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (9), e3673-e3681 (2021).
- Li, S., et al. Physical activity attenuates the genetic predisposition to obesity in 20,000 men and women from EPIC-Norfolk prospective population study. PLoS Medicine. 7 (8), e1000332 (2010).
- Claussnitzer, M., et al. FTO obesity variant circuitry and adipocyte browning in humans. The New England Journal of Medicine. 373 (10), 895-907 (2015).
- Tontonoz, P., Hu, E., Spiegelman, B. M. Stimulation of adipogenesis in fibroblasts by PPAR gamma 2, a lipid-activated transcription factor. Cell. 79 (7), 1147-1156 (1994).
- Seale, P., et al. Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16. Cell Metabolism. 6 (1), 38-54 (2007).
- Seale, P., et al. PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch. Nature. 454 (7207), 961-967 (2008).
- Rajakumari, S., et al. EBF2 determines and maintains brown adipocyte identity. Cell Metabolism. 17 (4), 562-574 (2013).
- Shapira, S. N., et al. EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex. Genes and Development. 31 (7), 660-673 (2017).
- Hiraike, Y., et al. NFIA co-localizes with PPARγ and transcriptionally controls the brown fat gene program. Nature Cell Biology. 19 (9), 1081-1092 (2017).
- Hiraike, Y., et al. NFIA differentially controls adipogenic and myogenic gene program through distinct pathways to ensure brown and beige adipocyte differentiation. PLoS Genetics. 16 (9), e1009044 (2020).
- Hiraike, Y., et al. NFIA determines the cis-effect of genetic variation on Ucp1 expression in murine thermogenic adipocytes. iScience. 25 (8), 104729 (2022).
- Villanueva, C. J., et al. Adipose subtype-selective recruitment of TLE3 or Prdm16 by PPARγ specifies lipid storage versus thermogenic gene programs. Cell Metabolism. 17 (3), 423-435 (2013).
- Pearson, S., et al. Loss of TLE3 promotes the mitochondrial program in beige adipocytes and improves glucose metabolism. Genes and Development. 33 (13-14), 747-762 (2019).
- Shao, M., et al. Zfp423 maintains white adipocyte identity through suppression of the beige cell thermogenic gene program. Cell Metabolism. 23 (6), 1167-1184 (2016).
- Green, H., Kehinde, O. Sublines of mouse 3T3 cells that accumulate lipid. Cell. 1 (3), 113-116 (1974).
- Green, H., Kehinde, O. An established preadipose cell line and its differentiation in culture II. Factors affecting the adipose conversion. Cell. 5 (1), 19-27 (1975).
- Green, H., Kehinde, O. Spontaneous heritable changes leading to increased adipose conversion in 3T3 cells. Cell. 7 (1), 105-113 (1976).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. Isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice. Journal of Visualized Experiments. (167), e62005 (2021).
- Priya, N., Sarcar, S., Majumdar, A. S., SundarRaj, S. Explant culture: a simple, reproducible, efficient and economic technique for isolation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue and lipoaspirate. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 706-716 (2014).
- Lockhart, R. A., Aronowitz, J. A., Dos-Anjos Vilaboa, S. Use of freshly isolated human adipose stromal cells for clinical applications. Aesthetic Surgery Journal. 37, S4-S8 (2017).
- Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy. 7 (12), 1063-1066 (2000).
- Li, Y., Fromme, T., Klingenspor, M. Meaningful respirometric measurements of UCP1-mediated thermogenesis. Biochimie. 134, 56-61 (2017).
- Hiraike, Y. Chromatin immunoprecipitation with mouse adipocytes using hypotonic buffer to enrich nuclear fraction before fixation. STAR Protocols. 4 (1), 102093 (2023).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
