Isolamento semi-automatico della frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo bianco murino mediante un dissociatore tissutale
Summary
Questo protocollo descrive l’isolamento semi-automatico della frazione vascolare stromale (SVF) dal tessuto adiposo murino per ottenere preadipociti e ottenere la differenziazione degli adipociti in vitro. L’uso di un dissociatore tissutale per la digestione della collagenasi riduce la variazione sperimentale e aumenta la riproducibilità.
Abstract
Lo studio in vitro della differenziazione degli adipociti bianchi, marroni e beige consente lo studio delle funzioni autonome cellulari degli adipociti e dei loro meccanismi. Le linee cellulari di preadipociti bianchi immortalizzati sono pubblicamente disponibili e ampiamente utilizzate. Tuttavia, l’emergere di adipociti beige nel tessuto adiposo bianco in risposta a segnali esterni è difficile da ricapitolare nella misura completa utilizzando linee cellulari di adipociti bianchi disponibili al pubblico. L’isolamento della frazione vascolare stromale (SVF) dal tessuto adiposo murino viene comunemente eseguito per ottenere preadipociti primari ed eseguire la differenziazione degli adipociti. Tuttavia, la tritatura e la digestione della collagenasi del tessuto adiposo a mano possono provocare variazioni sperimentali ed è soggetta a contaminazione. Qui, presentiamo un protocollo semi-automatico modificato che utilizza un dissociatore tissutale per la digestione della collagenasi per ottenere un più facile isolamento della SVF, con l’obiettivo di ridurre la variazione sperimentale, ridurre la contaminazione e aumentare la riproducibilità. I adipociti ottenuti e gli adipociti differenziati possono essere utilizzati per analisi funzionali e meccanicistiche.
Introduction
La biologia del tessuto adiposo ha attirato un’attenzione sempre maggiore a causa della crescente prevalenza dell’obesità e del diabete di tipo 2 a livello globale1. Gli adipociti immagazzinano l’energia in eccesso sotto forma di goccioline lipidiche, che vengono rilasciate per fame. Inoltre, il tessuto adiposo mantiene l’omeostasi energetica sistemica fungendo da organo endocrino e comunicando con altri tessuti 2,3. Curiosamente, sia l’eccesso di tessuto adiposo (obesità) che la perdita adiposa (lipodistrofia) sono legati all’insulino-resistenza e al diabete1. Gli adipociti sono divisi in tre tipi: bianco, marrone e beige1. Gli adipociti bianchi immagazzinano principalmente l’energia in eccesso come lipidi, mentre gli adipociti marroni e beige dissipano l’energia sotto forma di calore attraverso la proteina di disaccoppiamento mitocondriale-1 (Ucp1)1,4. In particolare, gli adipociti beige (chiamati anche adipociti bruni “inducibili”) compaiono nel tessuto adiposo bianco in risposta alla stimolazione fredda o simpatica e mostrano modelli di espressione genica che si sovrappongono ma sono distinti da quelli degli adipociti bruni “classici”5. Recentemente, gli adipociti marroni e beige sono stati anticipati come potenziali bersagli di trattamenti anti-obesità e anti-diabete volti a “migliorare la dissipazione di energia” piuttosto che “sopprimere l’apporto energetico”4. Supportivamente, l’allele di rischio della variante dell’obesità FTO rs1421085 nell’uomo, che mostra la più forte associazione con un indice di massa corporea (BMI) più elevato tra le varianti comuni6,7 e mostra varie interazioni gene-ambiente 8,9, è riportato per regolare negativamente la differenziazione e la funzione degli adipociti beige10. Il recettore attivato dal proliferatore dei perossisomi γ (PPARγ) è noto come regolatore trascrizionale principale dell’adipogenesi ed è necessario e sufficiente per la differenziazione degli adipociti11. I regolatori trascrizionali, come il dominio omologo PRD1-BF1-RIZ1 contenente 16 (PRDM16), il fattore precoce delle cellule b 2 (EBF2) e il fattore nucleare I-A (NFIA), sono cruciali per la differenziazione e la funzione degli adipociti marroni e beige 12,13,14,15,16,17,18. D’altra parte, la programmazione genica degli adipociti bianchi richiede regolatori trascrizionali, come la proteina enhancer transducina-simile 3 (TLE3) e la proteina delle dita di zinco 423 (ZFP423)19,20,21.
I sistemi modello in vitro consentono di eseguire studi molecolari che mirano a migliorare la comprensione dei meccanismi alla base delle funzioni e delle disfunzioni degli adipociti. Sebbene le linee cellulari di preadipociti pubblicamente disponibili e immortalate come 3T3-L1 e 3T3-F442A esistano22,23,24, la coltura di preadipociti primari e la differenziazione in adipociti sarebbe un modello più adatto per lo studio dell’adipogenesi in vivo. L’isolamento della frazione vascolare stromale (SVF) dal tessuto adiposo murino è un metodo ben noto per ottenere i preadipociti primari25,26. Tuttavia, la digestione della collagenasi del tessuto adiposo, che viene comunemente eseguita utilizzando uno shaker batterico con una cremagliera tubiera, può provocare variazioni sperimentali ed è soggetta a contaminazione27,28. Qui, descriviamo un protocollo alternativo che utilizza un dissociatore tissutale MACS (Gentle magnetic-activated cell sorting) per la digestione della collagenasi per ottenere un più facile isolamento della SVF.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, abbiamo descritto un protocollo per l’isolamento della SVF dal tessuto adiposo murino per ottenere preadipociti ed eseguire la differenziazione degli adipociti in vitro. L’uso di un dissociatore tissutale per la digestione della collagenasi ha ridotto la variazione sperimentale, diminuito il rischio di contaminazione e aumentato la riproducibilità. Sebbene questa procedura sia un passaggio critico all’interno del protocollo presentato, il processo è altamente automatizzato e non è necessaria l’ottimizzaz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Takahito Wada e Saiko Yoshida (The University of Tokyo, Tokyo, Giappone) per la loro assistenza sperimentale. Questo lavoro è stato finanziato dalle seguenti sovvenzioni a Y.H.: borsa di ricerca dell’Università di Tokyo Excellent Young Researcher Program; Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant-in-Aid for Early-Career Scientists, numero di sovvenzione 19K17976; sovvenzione per il Front Runner of Future Diabetes Research (FFDR) della Japan Foundation for Applied Enzymology, numero di sovvenzione 17F005; borsa di studio della Fondazione per la Ricerca Farmacologica; sovvenzione della Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research; sovvenzione della MSD Life Science Foundation; sovvenzione della Daiwa Securities Health Foundation; sovvenzione della Tokyo Biochemical Research Foundation; Borsa di ricerca Life Science della Takeda Science Foundation; e sovvenzione della SENSHIN Medical Research Foundation.
Materials
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 12 well plate | Corning | 3513 | |
| 60 mm dish | IWAKI | 3010-060 | |
| Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-105-808 | contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A |
| Cell strainer 70 µm | BD falcon | #352350 | |
| Collagen coated dishes, 100 mm | BD | #356450 | |
| Collagen coated dishes, 60 mm | BD | #354401 | |
| Collagen I Coat Microplate 6 well | IWAKI | 4810-010 | |
| Dexamethasone | Wako | 041-18861 | |
| Dissecting Forceps | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, blunt/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, sharp/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565-042 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | N/A | N/A | |
| gentleMACS C Tubes | Milteny Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACSOcto Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Humulin R Injection U-100 | Eli Lilly | 872492 | |
| Indomethacin | Sigma | I7378-5G | |
| Isobutylmethylxanthine (IBMX) | Sigma | 17018-1G | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Neomycin Sulfate | Fujifilm | 146-08871 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-062 | |
| pBABE-neo largeTcDNA (SV40) | Add gene | #1780 | |
| PBS tablets | Takara | T900 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | cell biolab | RV-101 | |
| Polybrene | Nacalai Tesque | 12996-81 | |
| Power Sybr Green Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | #FSQ-201 | |
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| Rosiglitazone | Wako | 180-02653 | |
| T3 | Sigma | T2877-100mg | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25200-056 |
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