优化无菌黄蜂的饲养程序

Summary

从蛹中解剖Nasonia蜂胚胎，寄生12-24 h后，用酒精和10%次氯酸钠溶液洗涤，得到无菌胚胎。在培育无菌胚胎并为其提供Nasonia饲养培养基进行体外生长和发育后，获得了无菌Nasonia成虫。

Abstract

无菌饲养技术是一种在不育或几乎无菌的条件下培养昆虫的方法，可以有效消除外界微生物对昆虫菌群的影响，从而促进昆虫菌群研究的快速发展。Nasonia（黄蜂属）是一种寄生蜂昆虫，具有寿命短、遗传变异高、操作方便等优点，被广泛用作昆虫模型系统。与只能减少动物体内微生物数量的抗生素处理不同，无菌饲养技术可以控制动物体内微生物的组成和数量，进一步促进宿主-微生物相互作用的研究。然而，以前版本的Nasonia饲养培养基（NRM）存在一些缺陷和问题，例如制备过程复杂且耗时，容易被细菌或真菌污染以及储存时间短。因此，本研究通过优化NRM制备过程中使用的工具，储存条件和组分比例来解决这些问题。优化后的培养基可以在-20°C下储存至少3个月，并消除在喂食无菌黄蜂时NRM污染的可能性。这进一步提高了无菌Nasonia的存活率和健康水平，这对于使用Nasonia作为微生物研究的模型非常重要。

Introduction

无菌动物是指没有可检测到的活微生物和寄生虫的动物¹.无菌胚胎可以通过在无菌条件下解剖母体来获得，随后在屏障系统中饲养²。这类动物可用于研究微生物对动物的影响，如对肠道微生物群、免疫系统和代谢^{的影响1。}通过一定的技术手段，许多昆虫甚至哺乳动物都可以不育3^，4。无菌动物具有独特的作用，并已广泛应用于微生物学研究的各个方面⁵.例如，使用无菌Nasonia黄蜂已经揭示了微生物可以帮助宿主在长期外源环境胁迫下适应新环境^6，7。

Nasonia寄生蜂是小型寄生蜂，将卵^注入苍蝇的蛹中4。Nasonia有四种已知的物种，包括Nasonia vitripennis，Nasonia longicornis，Nasonia giraulti和Nasonia oneida⁸。猪笼草可以在世界各地找到，而其他三个物种在北美的范围有限⁴. Nasonia寄生蜂因其易于栽培，繁殖周期短，基因组测序和长期滞育8^，9等特点而被认为是理想的模式昆虫。它们可用于研究昆虫进化、遗传学、发育、行为和共生的各个方面¹⁰.此外，Nasonia寄生蜂还可以帮助控制农业中的有害苍蝇和疾病¹¹。昆虫不育系统的成功建立涉及两个主要步骤：（1）胚胎绝育和（2）体外向幼虫提供无菌食品。为了获得无菌食品，布鲁克和博登斯坦¹²于2012年通过使用抗生素，漂白剂和胎牛血清等化学物质杀死细菌¹²，开发了Nasonia饲养培养基（NRMv1）。然而，化学灭菌方法导致猪笼草¹³的存活率和闭合率低。然后，在2016年，Shropshire等人通过使用过滤灭菌方法代替化学灭菌方法开发了NRMv2，以消除抗生素和其他物质的危害，并优化了育种过程¹³。不幸的是，这种方法仍然存在一些缺点，例如与制备和使用培养基相关的挑战，以及胚胎、幼虫和闭合蛹¹⁴ 的溺水、喂养不足或脱水的风险。Wang和Brucker¹⁴最近改进了Nasonia饲养培养基版本3（NRMv3）和无菌饲养版本2（GFRv2）协议。这些改进降低了成本和介质消耗。然而，NRMv3的储存时间非常短，极易受到污染。

本研究基于NRMv3，优化了NRM制备工具的储存方法和养分比例。这种方法的改进有助于使用猪笼草作为微生物组研究的模型。与Wang等人开发的NRMv3相比14，与Wang等人使用的带底孔的60 mL注射器相比，NRM原料之一的改进型挤压大疱石棺蛹的工具大大提高了大疱沙棺组织液的生产效率¹⁴。我们调整了NRM的养分比例，使无菌Nasonia黄蜂的成活率有了一定的提高，而不影响其发育时间。此外，将NRM装入小容量离心管（1.5 mL）中，并在-20°C冰箱中冷冻以延长储存时间。值得注意的是，虽然我们使用家蝇露西莉亚绅雪菌作为NRM制备的宿主和来源，但该协议可能适用于实验室中可用的其他Nasonia宿主。

Protocol

1.无菌纳索尼亚饲养培养基的制备  将市售的 绢毛蛹 （见 材料表）放在可以容纳所有蛹的表面上，例如托盘或一张纸。丢弃任何发育不全的幼虫、深色老蛹、空蛹壳、锯末或其他杂质。只保留棕红色的幼蛹，并将其转移到烧杯中（约3，000-4，000个蛹）。注意：经过多次实验，发现由深色老蛹制成的培养基很容易变黑，并阻止了无菌黄…

Representative Results

通过改进制备工具，大大提高了NRM的制备效率。此外，通过优化策略和保鲜方法，消除了饲喂过程中NRM污染的问题。同时，调整后的NRM对以 绢毛蚴为 寄主的无菌黄蜂的生长发育具有更适宜的营养配比。与使用GFRv2饲养的NRMv3无菌黄蜂相比，无菌黄蜂从幼虫到蛹的存活率显着提高（图2）。此外，无菌黄蜂和传统饲养的黄蜂之间的生成期没有差异（每代约14天）（<strong cl…

Discussion

随着基因组学、代谢组学等高通量检测技术的应用，研究人员逐渐意识到肠道微生物群中存在巨大的遗传多样性和代谢复杂性¹⁶。这些共生细菌通过与宿主的复杂相互作用，与宿主营养代谢、肿瘤、免疫力、衰老等各种生理或病理状态密切相关¹⁷。然而，与宿主中微生物种群的组成和功能网络相关的研究非常困难，因为每个自然个体中微生物的组成并不完全相同…

Materials

0.22 Sterile vacuum filter	NEST	331011
10% SodiumHypochlorite	LIRCON	XB-84BS-1
1x PBS solution	Solarbio	P1020
200 mesh nylon net	BIOBYING	BY-378Z
24 well-plate	NEST	702001
8, 1.2, 0.8, and 0.45 µm filters	Shanghai Xingya Purification Material Factory	HN-AA-JT-10079
Absolute ethyl alcohol	Macklin	E809057-500ml
Cell Strainer	BIOLOGIX	15-1100
Commercial Drosophila Medium	Boer	B645446-500ml
Dissecting needle	Bioroyee	17-9140
Garlic press	Taobao	No Catalog numbers	Purchase on Taobao
Lucillia sericata pupae	Hefei Dayuan Biotechnology Co., Ltd.	No Catalog numbers	Purchase on Taobao
Small writing brush	Cestidur	BL0508
Stereoscope	SOPTOP	RX50
Tweezers	SALMART	A109001-56