Optimización del procedimiento de cría de avispas libres de gérmenes

Summary

Los embriones de avispa Nasonia se diseccionaron de pupas de Lucillia sericata después de la parasitación durante 12-24 h y se lavaron con alcohol y solución de hipoclorito de sodio al 10% para obtener embriones libres de gérmenes. Después de criar los embriones libres de gérmenes y suministrarles el medio de cría Nasonia para crecer y desarrollarse in vitro, se obtuvieron adultos de Nasonia libres de gérmenes.

Abstract

La tecnología de cría aséptica es un método de cultivo de insectos en condiciones estériles o casi estériles, que puede eliminar eficazmente la influencia de microorganismos externos en la microbiota de los insectos y, por lo tanto, promover el rápido desarrollo de la investigación de la microbiota de los insectos. Nasonia (género de avispas) es un insecto avispa parásito que tiene muchas ventajas, como una vida útil corta, alta variación genética, fácil operación, etc., y es ampliamente utilizado como un sistema modelo de insectos. A diferencia del tratamiento antibiótico, que solo puede reducir el número de microorganismos en animales, las técnicas de cría aséptica pueden controlar tanto la composición como la cantidad de microorganismos en animales, facilitando aún más el estudio de las interacciones huésped-microbio. Sin embargo, las versiones anteriores del medio de cría Nasonia (NRM) tienen algunos defectos y problemas, como un proceso de preparación complejo y lento, fácil contaminación por bacterias u hongos y corto tiempo de almacenamiento. Por lo tanto, este estudio resuelve estos problemas optimizando las herramientas utilizadas en el proceso de preparación de MRN, las condiciones de almacenamiento y las proporciones de componentes. El medio optimizado podría permitir el almacenamiento a -20 °C durante al menos 3 meses y eliminar la posibilidad de contaminación por MRN durante la alimentación de avispas estériles. Esto mejora aún más la tasa de supervivencia y el nivel de salud de la Nasonia aséptica, que es importante para usar Nasonia como modelo para la investigación microbiana.

Introduction

Los animales libres de gérmenes son animales que no tienen microorganismos vivos detectables ni parásitos¹. Los embriones libres de gérmenes pueden obtenerse diseccionando a la madre en condiciones asépticas y posteriormente criados en sistemas de barrera². Estos animales pueden utilizarse para estudiar los efectos de los microorganismos en los animales, como la microbiota intestinal, el sistema inmunitario y el metabolismo¹. Con ciertos medios técnicos, muchos insectos e incluso mamíferos pueden volverse estériles ^3,4. Los animales libres de gérmenes tienen un papel único y han sido ampliamente utilizados en diversos aspectos de la investigación microbiológica⁵. Por ejemplo, el uso de avispas Nasonia libres de gérmenes ha revelado que los microorganismos pueden ayudar a los huéspedes a adaptarse a nuevos ambientes bajo estrés ambiental exógeno a largo plazo ^6,7.

Los parasitoides de Nasonia son pequeñas avispas parásitas que inyectan sus huevos en las pupas de las moscas⁴. Hay cuatro especies conocidas de Nasonia, incluyendo Nasonia vitripennis, Nasonia longicornis, Nasonia giraulti y Nasonia oneida⁸. N. vitripennis se puede encontrar en todo el mundo, mientras que las otras tres especies tienen rangos limitados en América del Norte⁴. Las avispas parasitoides Nasonia son consideradas como insectos modelo ideales debido a sus características, como fácil cultivo, ciclo de reproducción corto, genoma secuenciado y diapausa a largo plazo ^8,9. Se pueden utilizar para estudiar diversos aspectos de la evolución, la genética, el desarrollo, el comportamiento y la simbiosis de los insectos¹⁰. Además, las avispas parasitoides Nasonia también pueden ayudar a controlar las moscas dañinas en la agricultura y las enfermedades¹¹. El establecimiento exitoso de un sistema de insectos estériles implica dos pasos principales: (1) esterilización de los embriones y (2) provisión de alimentos estériles a las larvas in vitro. Para obtener alimentos estériles, Brucker y Bordenstein 12 desarrollaron el medio de cría Nasonia (NRMv1) en 2012 mediante el uso de productos químicos como antibióticos, lejía y suero bovino fetal para matar bacterias¹². Sin embargo, el método de esterilización química resultó en bajas tasas de supervivencia y eclosión de N. vitripennis¹³. Luego, en 2016, Shropshire et al. desarrollaron NRMv2 utilizando un método de esterilización por filtro en lugar de un método de esterilización química para eliminar los peligros de los antibióticos y otras sustancias, y optimizaron el proceso de reproducción¹³. Desafortunadamente, este método todavía tiene algunas desventajas, como los desafíos asociados con la preparación y el uso del medio, así como los riesgos de ahogamiento, subalimentación o deshidratación para los embriones, larvas y pupas cerradas¹⁴. Wang y Brucker¹⁴ mejoraron recientemente los protocolos de medios de cría Nasonia versión 3 (NRMv3) y la versión 2 de cría libre de gérmenes (GFRv2). Estas mejoras redujeron el costo y el consumo de medios. Sin embargo, el NRMv3 tiene un tiempo de almacenamiento muy corto y es altamente susceptible a la contaminación.

Sobre la base de NRMv3, el método de almacenamiento de la herramienta de preparación de NRM y la proporción de nutrientes se optimizaron en este estudio. Este refinamiento metodológico facilita el uso de N. vitripennis como modelo para estudios de microbiomas. En comparación con el NRMv3 desarrollado por Wang et al.14, la herramienta mejorada para exprimir la pupa Sarcophaga bullata, una de las materias primas del MRN, mejora en gran medida la eficiencia de producción del fluido tisular de S. bullata pupa en comparación con la jeringa de 60 ml con un orificio inferior utilizada por Wang et ^al.14. Ajustamos la proporción de nutrientes de NRM, lo que condujo a un cierto aumento en la tasa de supervivencia de las avispas Nasonia libres de gérmenes sin afectar su tiempo de desarrollo. Además, el NRM se envasó en tubos de centrífuga de pequeña capacidad (1,5 ml) y se congeló en un refrigerador de -20 ° C para extender el tiempo de almacenamiento. Vale la pena señalar que, si bien utilizamos la mosca doméstica Lucilia sericata como huésped y fuente para la preparación de MRN, este protocolo probablemente se puede adaptar para otros huéspedes de Nasonia que están disponibles en el laboratorio.

Protocol

1. Preparación de medio de cría deNasonia libre de gérmenes  Coloque las pupas de L. sericata disponibles comercialmente (consulte la Tabla de materiales) en una superficie que pueda acomodar todas las pupas, como una bandeja o una hoja de papel. Deseche cualquier larva subdesarrollada, pupas viejas oscuras, conchas de pupa vacías, aserrín u otras impurezas. Mantenga solo pupas jóvenes que sean de color rojo parduzco y transfiéralas a …

Representative Results

La eficiencia de preparación de NRM se mejoró enormemente al mejorar las herramientas de preparación. Además, se eliminó el problema de la contaminación por MRN en el proceso de alimentación optimizando la estrategia y el método de preservación. Al mismo tiempo, el MRN ajustado tenía una proporción nutricional más adecuada para el crecimiento y desarrollo de avispas libres de gérmenes con L. sericata como huéspedes. La tasa de supervivencia de las avispas libres de gérmenes desde larvas hasta pupa…

Discussion

Con la aplicación de tecnologías de detección de alto rendimiento como la genómica y la metabolómica, los investigadores se han dado cuenta gradualmente de que existe una enorme diversidad genética y complejidad metabólica en la microbiota intestinal¹⁶. Estas bacterias simbióticas están estrechamente relacionadas con diversos estados fisiológicos o patológicos, como el metabolismo nutricional del huésped, los tumores, la inmunidad y el envejecimiento a través de interacciones compleja…

Materials

0.22 Sterile vacuum filter	NEST	331011
10% SodiumHypochlorite	LIRCON	XB-84BS-1
1x PBS solution	Solarbio	P1020
200 mesh nylon net	BIOBYING	BY-378Z
24 well-plate	NEST	702001
8, 1.2, 0.8, and 0.45 µm filters	Shanghai Xingya Purification Material Factory	HN-AA-JT-10079
Absolute ethyl alcohol	Macklin	E809057-500ml
Cell Strainer	BIOLOGIX	15-1100
Commercial Drosophila Medium	Boer	B645446-500ml
Dissecting needle	Bioroyee	17-9140
Garlic press	Taobao	No Catalog numbers	Purchase on Taobao
Lucillia sericata pupae	Hefei Dayuan Biotechnology Co., Ltd.	No Catalog numbers	Purchase on Taobao
Small writing brush	Cestidur	BL0508
Stereoscope	SOPTOP	RX50
Tweezers	SALMART	A109001-56