Optimering af opdrætsproceduren for kimfrie hveps

Summary

Nasonia hvepseembryoner blev dissekeret fra Lucillia sericata pupper efter parasitering i 12-24 timer og vasket med alkohol og 10% natriumhypochloritopløsning for at opnå kimfrie embryoner. Efter opdræt af de kimfrie embryoner og levering af Nasonia-opdrætsmedium til at vokse og udvikle in vitro, blev kimfrie Nasonia-voksne opnået.

Abstract

Aseptisk opdrætsteknologi er en metode til dyrkning af insekter under sterile eller næsten sterile forhold, som effektivt kan eliminere eksterne mikroorganismers indflydelse på insekters mikrobiota og dermed fremme den hurtige udvikling af forskning i insektmikrobiota. Nasonia (hvepseslægt) er et parasitisk hvepseinsekt, der har mange fordele, såsom en kort levetid, høj genetisk variation, nem betjening osv., Og bruges i vid udstrækning som et insektmodelsystem. I modsætning til antibiotikabehandling, som kun kan reducere antallet af mikroorganismer hos dyr, kan aseptiske opdrætsteknikker kontrollere både sammensætningen og mængden af mikroorganismer hos dyr, hvilket yderligere letter undersøgelsen af interaktioner mellem vært og mikrober. Tidligere versioner af Nasonia-opdrætsmedium (NRM) har dog nogle defekter og problemer, såsom en kompleks og tidskrævende forberedelsesproces, let forurening med bakterier eller svampe og kort opbevaringstid. Derfor løser denne undersøgelse disse problemer ved at optimere de værktøjer, der anvendes i NRM-forberedelsesprocessen, opbevaringsforhold og komponentforhold. Det optimerede medium kan tillade opbevaring ved -20 °C i mindst 3 måneder og eliminere muligheden for NRM-kontaminering under fodring af sterile hvepse. Dette forbedrer yderligere overlevelsesraten og sundhedsniveauet for aseptisk Nasonia , hvilket er vigtigt for at bruge Nasonia som model for mikrobiel forskning.

Introduction

Kimfrie dyr er dyr, der ikke har påviselige levende mikroorganismer og parasitter¹. Kimfrie embryoner kan opnås ved at dissekere moderen under aseptiske forhold og efterfølgende opfostres i barrieresystemer². Sådanne dyr kan bruges til at studere virkningerne af mikroorganismer på dyr, såsom på tarmmikrobiotaen, immunsystemet og stofskiftet¹. Med visse tekniske midler kan mange insekter og endda pattedyr gøres sterile ^3,4. Bakteriefrie dyr spiller en unik rolle og har været meget udbredt i forskellige aspekter af mikrobiologisk forskning⁵. For eksempel har brugen af kimfri Nasonia-hvepse afsløret, at mikroorganismer kan hjælpe værter med at tilpasse sig nye miljøer under langvarig eksogen miljøbelastning ^6,7.

Nasonia parasitoider er små parasitære hveps, der injicerer deres æg i fluens pupper⁴. Der er fire kendte arter af Nasonia, herunder Nasonia vitripennis, Nasonia longicornis, Nasonia giraulti og Nasonia oneida⁸. N. vitripennis findes over hele verden, mens de tre andre arter har begrænsede områder i Nordamerika⁴. Nasonia parasitoide hvepse betragtes som ideelle modelinsekter på grund af deres egenskaber, såsom let dyrkning, kort reproduktionscyklus, sekventeret genom og langvarig diapause ^8,9. De kan bruges til at studere forskellige aspekter af insektudvikling, genetik, udvikling, adfærd og symbiose¹⁰. Desuden kan Nasonia parasitoide hvepse også hjælpe med at kontrollere skadelige fluer i landbruget og sygdom¹¹. En vellykket etablering af et sterilt insektsystem indebærer to hovedtrin: (1) sterilisering af embryonerne og (2) levering af steril mad til larverne in vitro. For at opnå steril mad udviklede Brucker og Bordenstein 12 Nasonia-opdrætsmedium (NRMv1) i 2012 ved at bruge kemikalier som antibiotika, blegemiddel og føtalt bovin serum til at dræbe bakterier¹². Den kemiske steriliseringsmetode resulterede imidlertid i lave overlevelses- og eclosionsrater af N. vitripennis¹³. Derefter udviklede Shropshire et al. i 2016 NRMv2 ved hjælp af en filtersteriliseringsmetode i stedet for en kemisk steriliseringsmetode for at eliminere farerne ved antibiotika og andre stoffer og optimerede avlsprocessen¹³. Desværre har denne metode stadig nogle ulemper, såsom udfordringerne forbundet med forberedelse og brug af mediet samt risikoen for drukning, underfodring eller dehydrering for embryoner, larver og lukkede pupper¹⁴. Wang og Brucker¹⁴ forbedrede for nylig Nasonia opdrætsmedier version 3 (NRMv3) og de kimfri opdræt version 2 (GFRv2) protokoller. Disse forbedringer reducerede omkostningerne og medieforbruget. NRMv3 har dog en meget kort opbevaringstid og er meget modtagelig for kontaminering.

Med udgangspunkt i NRMv3 blev NRM-forberedelsesværktøjets opbevaringsmetode og næringsstofforhold optimeret i denne undersøgelse. Denne metodologiske forbedring letter brugen af N. vitripennis som model for mikrobiomundersøgelser. Sammenlignet med NRMv3 udviklet af Wang et al.14 forbedrer det forbedrede værktøj til presning af Sarcophaga bullata puppe, et af NRM-råmaterialerne, i høj grad produktionseffektiviteten af S. bullata puppevævsvæske sammenlignet med 60 ml sprøjten med et bundhul, der anvendes af Wang et al.14. Vi justerede næringsstofforholdet mellem NRM, hvilket førte til en vis stigning i overlevelsesraten for kimfrie Nasonia-hvepse uden at påvirke deres udviklingstid. Derudover blev NRM pakket i centrifugerør med lille kapacitet (1,5 ml) og frosset i et køleskab på -20 °C for at forlænge opbevaringstiden. Det er værd at bemærke, at mens vi brugte stuefluen Lucilia sericata som vært og kilde til NRM-forberedelse, kan denne protokol sandsynligvis tilpasses til andre Nasonia-værter, der er tilgængelige i laboratoriet.

Protocol

1. Fremstilling af kimfritNasonia-opdrætsmedium  Placer de kommercielt tilgængelige L. sericata pupper (se Tabel over materialer) på en overflade, der kan rumme alle pupperne, såsom en bakke eller et ark papir. Kassér eventuelle underudviklede larver, mørke gamle pupper, tomme puppeskaller, savsmuld eller andre urenheder. Opbevar kun unge pupper, der er brunrøde i farven, og overfør dem til et bægerglas (ca. 3.000-4.000 pupper).B…

Representative Results

Forberedelseseffektiviteten af NRM blev stærkt forbedret ved at forbedre forberedelsesværktøjerne. Derudover blev problemet med NRM-forurening i fodringsprocessen elimineret ved at optimere strategien og bevaringsmetoden. Samtidig havde den justerede NRM et mere passende ernæringsforhold til vækst og udvikling af kimfrie hvepse med L. sericata som værter. Overlevelsesraten for bakteriefrie hvepse fra larver til pupper blev signifikant forbedret sammenlignet med kimfrie hvepse opdrættet med NRMv3 ved hjæl…

Discussion

Med anvendelsen af high-throughput detektionsteknologier såsom genomik og metabolomics har forskere gradvist indset, at der er enorm genetisk mangfoldighed og metabolisk kompleksitet i tarmmikrobiota¹⁶. Disse symbiotiske bakterier er tæt forbundet med forskellige fysiologiske eller patologiske tilstande, såsom værtens ernæringsmæssige metabolisme, tumorer, immunitet og aldring gennem komplekse interaktioner med værten¹⁷. Forskningen relateret til netværket af sammen…

Materials

0.22 Sterile vacuum filter	NEST	331011
10% SodiumHypochlorite	LIRCON	XB-84BS-1
1x PBS solution	Solarbio	P1020
200 mesh nylon net	BIOBYING	BY-378Z
24 well-plate	NEST	702001
8, 1.2, 0.8, and 0.45 µm filters	Shanghai Xingya Purification Material Factory	HN-AA-JT-10079
Absolute ethyl alcohol	Macklin	E809057-500ml
Cell Strainer	BIOLOGIX	15-1100
Commercial Drosophila Medium	Boer	B645446-500ml
Dissecting needle	Bioroyee	17-9140
Garlic press	Taobao	No Catalog numbers	Purchase on Taobao
Lucillia sericata pupae	Hefei Dayuan Biotechnology Co., Ltd.	No Catalog numbers	Purchase on Taobao
Small writing brush	Cestidur	BL0508
Stereoscope	SOPTOP	RX50
Tweezers	SALMART	A109001-56