אופטימיזציה של הליך הגידול של צרעות נטולות חיידקים
Summary
עוברי צרעת נסוניה נותחו מגלמי Lucillia sericata לאחר טפילים במשך 12-24 שעות ונשטפו בתמיסת אלכוהול ונתרן היפוכלוריט 10% כדי להשיג עוברים נטולי חיידקים. לאחר גידול העוברים נטולי הנבט ואספקת מצע גידול נסוניה, כדי לגדול ולהתפתח במבחנה, התקבלו בוגרים נטולי חיידקים של נסוניה.
Abstract
טכנולוגיית גידול אספטי היא שיטה לגידול חרקים בתנאים סטריליים או כמעט סטריליים, אשר יכולה לחסל ביעילות את ההשפעה של מיקרואורגניזמים חיצוניים על מיקרוביוטה של חרקים ובכך לקדם את ההתפתחות המהירה של מחקר מיקרוביוטה חרקים. נסוניה (סוג צרעה) הוא חרק צרעה טפילי בעל יתרונות רבים, כגון תוחלת חיים קצרה, שונות גנטית גבוהה, תפעול קל ועוד, ונמצא בשימוש נרחב כמערכת מודל חרקים. שלא כמו טיפול אנטיביוטי, אשר יכול רק להפחית את מספר המיקרואורגניזמים בבעלי חיים, טכניקות גידול אספטיות יכולות לשלוט הן על הרכב וכמות מיקרואורגניזמים בבעלי חיים, מה שמקל עוד יותר על המחקר של אינטראקציות מיקרואורגניזם מארח. עם זאת, גרסאות קודמות של מדיום גידול Nasonia (NRM) יש כמה פגמים ובעיות, כגון תהליך הכנה מורכב וגוזל זמן, זיהום קל על ידי חיידקים או פטריות, וזמן אחסון קצר. לכן, מחקר זה פותר בעיות אלה על ידי אופטימיזציה של הכלים המשמשים בתהליך הכנת NRM, תנאי אחסון ויחסי רכיבים. התווך הממוטב יכול לאפשר אחסון בטמפרטורה של -20°C למשך 3 חודשים לפחות ולמנוע את האפשרות של זיהום NRM במהלך האכלת צרעות סטריליות. זה משפר עוד יותר את שיעור ההישרדות ואת רמת הבריאות של Nasonia אספטית, אשר חשוב לשימוש Nasonia כמודל למחקר מיקרוביאלי.
Introduction
בעלי חיים נטולי חיידקים הם בעלי חיים שאין להם מיקרואורגניזמים חיים וטפילים הניתנים לזיהוי1. ניתן להשיג עוברים נטולי חיידקים על ידי ניתוח האם בתנאים אספטיים ולאחר מכן לגדלם במערכות מחסום2. בעלי חיים כאלה יכולים לשמש לחקר ההשפעות של מיקרואורגניזמים על בעלי חיים, כגון על המיקרוביוטה של המעי, מערכת החיסון וחילוף החומרים1. באמצעים טכניים מסוימים, חרקים רבים ואפילו יונקים יכולים להפוך לסטריליים 3,4. לבעלי חיים נטולי חיידקים יש תפקיד ייחודי והם נמצאים בשימוש נרחב בהיבטים שונים של מחקר מיקרוביולוגי5. לדוגמה, השימוש בצרעות Nasonia נטולות חיידקים גילה כי מיקרואורגניזמים יכולים לעזור למארחים להסתגל לסביבות חדשות תחת לחץ סביבתי אקסוגני ארוך טווח 6,7.
טפילי נסוניה הם צרעות טפיליות קטנות המזריקות את ביציהן לגלמים של זבובים4. ישנם ארבעה מינים ידועים של נסוניה, כולל Nasonia vitripennis, Nasonia longicornis, Nasonia giraulti ו– Nasonia oneida8. ניתן למצוא N. vitripennis ברחבי העולם, בעוד שלשלושת המינים האחרים יש טווח מוגבל בצפון אמריקה4. צרעות טפיליות נסוניה נחשבות לחרקים מודל אידיאליים בגלל המאפיינים שלהן, כגון גידול קל, מחזור רבייה קצר, רצף גנום ודיאפאוזה 8,9 לטווח ארוך. ניתן להשתמש בהם כדי לחקור היבטים שונים של אבולוציה של חרקים, גנטיקה, התפתחות, התנהגות וסימביוזה10. יתר על כן, צרעות טפיליות נסוניה יכולות גם לסייע בהדברת זבובים מזיקים בחקלאות ובמחלות11. הקמתה המוצלחת של מערכת חרקים סטרילית כרוכה בשני שלבים עיקריים: (1) עיקור העוברים ו-(2) אספקת מזון סטרילי לזחלים במבחנה. על מנת להשיג מזון סטרילי, ברוקר ובורדנשטיין 12 פיתחו מדיום גידול נסוניה (NRMv1) בשנת 2012 על ידי שימוש בכימיקלים כגון אנטיביוטיקה, אקונומיקה וסרום בקר עוברי כדי להרוג חיידקים12. עם זאת, שיטת העיקור הכימי הביאה לשיעורי הישרדות ואקלוסיה נמוכים של N. vitripennis13. לאחר מכן, בשנת 2016, Shropshire et al. פיתחו את NRMv2 באמצעות שיטת עיקור מסנן במקום שיטת עיקור כימי כדי לחסל את הסיכונים של אנטיביוטיקה וחומרים אחרים, וייעלו את תהליך הרבייה13. למרבה הצער, לשיטה זו יש עדיין כמה חסרונות, כגון האתגרים הקשורים להכנת המדיום והשימוש בו, כמו גם הסיכונים לטביעה, תת-האכלה או התייבשות עבור העוברים, הזחלים והגלמים הסגורים14. וואנג וברוקר14 שיפרו לאחרונה את גרסת המדיה לגידול Nasonia גרסה 3 (NRMv3) ואת פרוטוקולי הגרסה 2 (GFRv2) לגידול ללא חיידקים. שיפורים אלה הפחיתו את העלות ואת צריכת המדיה. עם זאת, ל-NRMv3 יש זמן אחסון קצר מאוד והוא רגיש מאוד לזיהום.
בהתבסס על NRMv3, שיטת אחסון כלי ההכנה של NRM ויחס החומרים המזינים עברו אופטימיזציה במחקר זה. עידון מתודולוגי זה מאפשר שימוש ב-N. vitripennis כמודל למחקרי מיקרוביום. בהשוואה ל- NRMv3 שפותח על ידי וואנג ואחרים 14, הכלי המשופר לסחיטת סרקופגה בולטה גולם, אחד מחומרי הגלם של NRM, משפר מאוד את יעילות הייצור של נוזל רקמת S. bullata pupa בהשוואה למזרק 60 מ”ל עם חור תחתון המשמש את וואנג ואחרים 14. התאמנו את יחס החומרים המזינים של NRM, מה שהוביל לעלייה מסוימת בשיעור ההישרדות של צרעות נסוניה נטולות חיידקים מבלי להשפיע על זמן ההתפתחות שלהן. בנוסף, ה-NRM נארז בצינורות צנטריפוגות בעלי קיבולת קטנה (1.5 מ”ל) והוקפא במקרר בטמפרטורה של -20°C כדי להאריך את זמן האחסון. ראוי לציין כי בעוד שהשתמשנו בזבוב הבית Lucilia sericata כמארח וכמקור להכנת NRM, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם ככל הנראה למארחי Nasonia אחרים הזמינים במעבדה.
Protocol
Representative Results
Discussion
עם היישום של טכנולוגיות זיהוי תפוקה גבוהה כגון גנומיקה ומטבולומיקה, חוקרים הבינו בהדרגה שיש מגוון גנטי עצום ומורכבות מטבולית במיקרוביוטה של המעי16. חיידקים סימביוטיים אלה קשורים קשר הדוק למצבים פיזיולוגיים או פתולוגיים שונים, כגון מטבוליזם תזונתי של המאכסן, גידולים, חסינות ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מימון: עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע של סין (32270538), תוכנית המו”פ הלאומית של סין (2022YFF0710603), הקרן למדעי הטבע של בייג’ינג (6222046), והמימון האסטרטגי של CAS באמצעות תוכנית המימון CAS-CSIRO (152111KYSB20210011) שהוענק ל- G.H.W. תרומות מחברים: כל המחברים פיתחו את היקף ומיקוד הסקירה ותרמו לכתיבת כתב היד.
Materials
| 0.22 Sterile vacuum filter | NEST | 331011 | |
| 10% SodiumHypochlorite | LIRCON | XB-84BS-1 | |
| 1x PBS solution | Solarbio | P1020 | |
| 200 mesh nylon net | BIOBYING | BY-378Z | |
| 24 well-plate | NEST | 702001 | |
| 8, 1.2, 0.8, and 0.45 µm filters | Shanghai Xingya Purification Material Factory | HN-AA-JT-10079 | |
| Absolute ethyl alcohol | Macklin | E809057-500ml | |
| Cell Strainer | BIOLOGIX | 15-1100 | |
| Commercial Drosophila Medium | Boer | B645446-500ml | |
| Dissecting needle | Bioroyee | 17-9140 | |
| Garlic press | Taobao | No Catalog numbers | Purchase on Taobao |
| Lucillia sericata pupae | Hefei Dayuan Biotechnology Co., Ltd. | No Catalog numbers | Purchase on Taobao |
| Small writing brush | Cestidur | BL0508 | |
| Stereoscope | SOPTOP | RX50 | |
| Tweezers | SALMART | A109001-56 |
References
- Diviccaro, S., et al. Exploring the impact of the microbiome on neuroactive steroid levels in germ-free animals. International Journal of Molecular Sciences. 22 (22), 12551 (2021).
- Pang, X., et al. Inter-species transplantation of gut microbiota from human to pigs. The ISME Journal. 1 (2), 156-162 (2007).
- Uzbay, T. Germ-free animal experiments in the gut microbiota studies. Current Opinion in Pharmacology. 49, 6-10 (2019).
- Zhu, Z., Liu, Y., Hu, H., Wang, G. -. H. Nasonia-microbiome associations: a model for evolutionary hologenomics research. Trends in Parasitology. 39 (2), 101-112 (2022).
- Li, J., Wei, H. Establishment of an efficient germ-free animal system to support functional microbiome research. Science China Life Sciences. 62 (10), 1400-1403 (2019).
- Wang, G. H., et al. Changes in microbiome confer multigenerational host resistance after sub-toxic pesticide exposure. Cell Host Microbe. 27 (2), 213-224 (2020).
- Wang, G. H., Dittmer, J., Douglas, B., Huang, L., Brucker, R. M. Coadaptation between host genome and microbiome under long-term xenobiotic-induced selection. Science Advances. 7 (19), (2021).
- Dittmer, J., Brucker, R. M. When your host shuts down: larval diapause impacts host-microbiome interactions in Nasonia vitripennis. Microbiome. 9 (1), 85 (2021).
- Dittmer, J., et al. Disentangling a holobiont-recent advances and perspectives in Nasonia wasps. Frontiers in Microbiology. 7, 1478 (2016).
- Brooks, A. W., Kohl, K. D., Brucker, R. M., van Opstal, E. J., Bordenstein, S. R. Phylosymbiosis: relationships and functional effects of microbial communities across host evolutionary history. PLoS Biology. 14 (11), e2000225 (2016).
- Heavner, M. E., et al. Partial venom gland transcriptome of a Drosophila parasitoid wasp, Leptopilina heterotoma, reveals novel and shared bioactive profiles with stinging Hymenoptera. Gene. 526 (2), 195-204 (2013).
- Brucker, R. M., Bordenstein, S. R. In vitro cultivation of the hymenoptera genetic model, Nasonia. PLoS One. 7 (12), e51269 (2012).
- Shropshire, J. D., van Opstal, E. J., Bordenstein, S. R. An optimized approach to germ-free rearing in the jewel wasp Nasonia. PeerJ. 4, e2316 (2016).
- Wang, G. H., Brucker, R. M. An optimized method for Nasonia germ-free rearing. Scientific Reports. 12 (1), 219 (2022).
- Brucker, R. M., Bordenstein, S. R. The hologenomic basis of speciation: gut bacteria cause hybrid lethality in the genus Nasonia. Science. 341 (6146), 667-669 (2013).
- Fontaine, C. A., et al. How free of germs is germ-free? Detection of bacterial contamination in a germ free mouse unit. Gut Microbes. 6 (4), 225-233 (2015).
- Mazmanian, S. K., Liu, C. H., Tzianabos, A. O., Kasper, D. L. An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system. Cell. 122 (1), 107-118 (2005).
- Weersma, R. K., Zhernakova, A., Fu, J. Interaction between drugs and the gut microbiome. Gut. 69 (8), 1510-1519 (2020).
