Optimering av uppfödningsförfarandet för bakteriefria getingar

Summary

Nasonia getingembryon dissekerades från Lucillia sericata puppor efter parasitering i 12-24 timmar och tvättades med alkohol och 10% natriumhypokloritlösning för att erhålla bakteriefria embryon. Efter uppfödning av bakteriefria embryon och förmedling av dem med Nasonia-uppfödningsmedium för att växa och utvecklas in vitro, erhölls bakteriefria vuxna Nasonia-växter.

Abstract

Aseptisk uppfödningsteknik är en metod för odling av insekter under sterila eller nästan sterila förhållanden, vilket effektivt kan eliminera påverkan av externa mikroorganismer på insektsmikrobiota och därmed främja den snabba utvecklingen av insektsmikrobiotaforskning. Nasonia (getingsläkte) är en parasitisk getinginsekt som har många fördelar, såsom en kort livslängd, hög genetisk variation, enkel användning etc., och används ofta som ett insektsmodellsystem. Till skillnad från antibiotikabehandling, som bara kan minska antalet mikroorganismer hos djur, kan aseptiska uppfödningstekniker styra både sammansättningen och mängden mikroorganismer hos djur, vilket ytterligare underlättar studien av värd-mikrobinteraktioner. Tidigare versioner av Nasonia uppfödningsmedium (NRM) har dock vissa defekter och problem, såsom en komplex och tidskrävande beredningsprocess, enkel kontaminering av bakterier eller svampar och kort lagringstid. Därför löser denna studie dessa problem genom att optimera verktygen som används i NRM-förberedelseprocessen, lagringsförhållanden och komponentförhållanden. Det optimerade mediet kan möjliggöra förvaring vid -20 °C i minst 3 månader och eliminera risken för NRM-kontaminering vid utfodring av sterila getingar. Detta förbättrar ytterligare överlevnaden och hälsonivån för aseptisk Nasonia, vilket är viktigt för att använda Nasonia som modell för mikrobiell forskning.

Introduction

Bakteriefria djur är djur som inte har några detekterbara levande mikroorganismer och parasiter¹. Bakteriefria embryon kan erhållas genom dissekering av modern under aseptiska förhållanden och därefter uppfödas i barriärsystem². Sådana djur kan användas för att studera effekterna av mikroorganismer på djur, såsom på tarmmikrobioten, immunsystemet och ämnesomsättningen¹. Med vissa tekniska medel kan många insekter och till och med däggdjur göras sterila ^3,4. Bakteriefria djur har en unik roll och har använts i stor utsträckning inom olika aspekter av mikrobiologisk forskning⁵. Till exempel har användningen av bakteriefria Nasonia-getingar visat att mikroorganismer kan hjälpa värdar att anpassa sig till nya miljöer under långvarig exogen miljöstress ^6,7.

Nasonia parasitoider är små parasitsteklar som injicerar sina ägg i flugornas puppor⁴. Det finns fyra kända arter av Nasonia, inklusive Nasonia vitripennis, Nasonia longicornis, Nasonia giraulti och Nasonia oneida⁸. N. vitripennis finns över hela världen, medan de andra tre arterna har begränsade utbredningsområden i Nordamerika⁴. Nasonia parasitoida getingar betraktas som idealiska modellinsekter på grund av deras egenskaper, såsom lätt odling, kort reproduktionscykel, sekvenserat genom och långvarig diapaus ^8,9. De kan användas för att studera olika aspekter av insektsutveckling, genetik, utveckling, beteende och symbios¹⁰. Dessutom kan Nasonia parasitoida getingar också hjälpa till att kontrollera skadliga flugor i jordbruk och sjukdom¹¹. Den framgångsrika etableringen av ett sterilt insektssystem innebär två huvudsteg: (1) sterilisering av embryon och (2) tillhandahållande av steril mat till larverna in vitro. För att få steril mat utvecklade Brucker och Bordenstein 12 Nasonia uppfödningsmedium (NRMv1) 2012 genom att använda kemikalier som antibiotika, blekmedel och fetalt bovint serum för att döda bakterier¹². Den kemiska steriliseringsmetoden resulterade emellertid i låg överlevnad och eclosionshastigheter av N. vitripennis¹³. Sedan, 2016, utvecklade Shropshire et al. NRMv2 genom att använda en filtersteriliseringsmetod istället för en kemisk steriliseringsmetod för att eliminera farorna med antibiotika och andra ämnen och optimerade avelsprocessen¹³. Tyvärr har denna metod fortfarande vissa nackdelar, såsom utmaningarna i samband med beredning och användning av mediet, liksom riskerna för drunkning, undermatning eller uttorkning för embryon, larver och slutna puppor¹⁴. Wang och Brucker¹⁴ förbättrade nyligen Nasonia uppfödningsmedia version 3 (NRMv3) och bakteriefri uppfödning version 2 (GFRv2) protokoll. Dessa förbättringar minskade kostnaden och medieförbrukningen. NRMv3 har dock en mycket kort lagringstid och är mycket känslig för kontaminering.

Baserat på NRMv3 optimerades lagringsmetoden och näringsförhållandet för NRM-beredningsverktyget i denna studie. Denna metodologiska förfining underlättar användningen av N. vitripennis som modell för mikrobiomstudier. Jämfört med NRMv3 som utvecklats av Wang et al.14, förbättrar det förbättrade verktyget för att pressa Sarcophaga bullata pupa, ett av NRM-råmaterialen, kraftigt produktionseffektiviteten för S. bullata pupa vävnadsvätska jämfört med 60 ml spruta med ett bottenhål som används av Wang et al.14. Vi justerade näringsförhållandet för NRM, vilket ledde till en viss ökning av överlevnadsgraden för bakteriefria Nasonia-getingar utan att påverka deras utvecklingstid. Dessutom packades NRM i centrifugrör med liten kapacitet (1,5 ml) och frystes i ett kylskåp på -20 °C för att förlänga lagringstiden. Det är värt att notera att medan vi använde husflugan Lucilia sericata som värd och källa för NRM-förberedelse, kan detta protokoll sannolikt anpassas för andra Nasonia-värdar som finns tillgängliga i laboratoriet.

Protocol

1. Beredning av bakteriefrittuppfödningsmedium frånNasonia  Placera de kommersiellt tillgängliga L. sericata pupporna (se Materialförteckning) på en yta som rymmer alla puppor, till exempel en bricka eller ett pappersark. Kassera alla underutvecklade larver, mörka gamla puppar, tomma valpskal, sågspån eller andra föroreningar. Håll endast unga puppor som är brunröda i färg och överför dem till en bägare (cirka 3 000-4 000 pupp…

Representative Results

Förberedelseeffektiviteten för NRM förbättrades avsevärt genom att förbättra beredningsverktygen. Dessutom eliminerades problemet med NRM-föroreningar i utfodringsprocessen genom att optimera strategin och konserveringsmetoden. Samtidigt hade den justerade NRM ett mer lämpligt näringsförhållande för tillväxt och utveckling av bakteriefria getingar med L. sericata som värdar. Överlevnaden för bakteriefria getingar från larver till puppor förbättrades signifikant jämfört med bakteriefria geti…

Discussion

Med tillämpningen av detekteringstekniker med hög genomströmning som genomik och metabolomik har forskare gradvis insett att det finns enorm genetisk mångfald och metabolisk komplexitet i tarmmikrobiota¹⁶. Dessa symbiotiska bakterier är nära besläktade med olika fysiologiska eller patologiska tillstånd, såsom värdnäringsmetabolism, tumörer, immunitet och åldrande genom komplexa interaktioner med värden¹⁷. Forskningen relaterad till nätverket av sammansättnin…

Materials

0.22 Sterile vacuum filter	NEST	331011
10% SodiumHypochlorite	LIRCON	XB-84BS-1
1x PBS solution	Solarbio	P1020
200 mesh nylon net	BIOBYING	BY-378Z
24 well-plate	NEST	702001
8, 1.2, 0.8, and 0.45 µm filters	Shanghai Xingya Purification Material Factory	HN-AA-JT-10079
Absolute ethyl alcohol	Macklin	E809057-500ml
Cell Strainer	BIOLOGIX	15-1100
Commercial Drosophila Medium	Boer	B645446-500ml
Dissecting needle	Bioroyee	17-9140
Garlic press	Taobao	No Catalog numbers	Purchase on Taobao
Lucillia sericata pupae	Hefei Dayuan Biotechnology Co., Ltd.	No Catalog numbers	Purchase on Taobao
Small writing brush	Cestidur	BL0508
Stereoscope	SOPTOP	RX50
Tweezers	SALMART	A109001-56