Porfyrinmodifiserte perler til bruk som kompensasjonskontroll i flowcytometri
Summary
Protokollen beskriver hvordan porfyrinbaserte kompensasjonsperler for flowcytometri fremstilles ved reaksjon av aminfunksjonaliserte polystyrenkuler med porfyrin TCPP og amidkoblingsreagenset EDC. En filtreringsprosedyre brukes til å redusere partikkelformige biprodukter.
Abstract
Flowcytometri kan raskt karakterisere og kvantifisere ulike cellepopulasjoner basert på fluorescensmålinger. Cellene blir først farget med en eller flere fluorescerende reagenser, hver funksjonalisert med et annet fluorescerende molekyl (fluorofor) som binder seg til celler selektivt basert på deres fenotypiske egenskaper, for eksempel celleoverflateantigenuttrykk. Intensiteten av fluorescens fra hvert reagens bundet til celler kan måles på flowcytometeret ved hjelp av kanaler som oppdager et spesifisert bølgelengdeområde. Når flere fluoroforer brukes, søler lyset fra individuelle fluoroforer ofte over i uønskede deteksjonskanaler, noe som krever en korreksjon av fluorescensintensitetsdataene i en prosess som kalles kompensasjon.
Kompensasjonskontrollpartikler, vanligvis polymerperler bundet til en enkelt fluorofor, er nødvendig for hver fluorofor som brukes i et cellemerkingseksperiment. Data fra kompensasjonspartikler fra flowcytometeret brukes til å korrigere fluorescensintensitetsmålingene. Denne protokollen beskriver fremstilling og rensing av polystyrenkompensasjonsperler kovalent funksjonalisert med det fluorescerende reagenset meso-tetra (4-karboksyphenyl) porfin (TCPP) og deres anvendelse i flowcytometrikompensasjon. I dette arbeidet ble aminfunksjonaliserte polystyrenperler behandlet med TCPP og amidkoblingsreagenset EDC (N-(3-dimetylaminopropyl)-N′-etylkarbodiimidhydroklorid) ved pH 6 og ved romtemperatur i 16 timer med omrøring. TCPP-kulene ble isolert ved sentrifugering og resuspendert i en pH 7-buffer for lagring. TCPP-relaterte partikler ble observert som biprodukt. Antallet av disse partiklene kan reduseres ved hjelp av en valgfri filtreringsprotokoll. De resulterende TCPP-perlene ble vellykket brukt på et flowcytometer for kompensasjon i eksperimenter med humane sputumceller merket med flere fluoroforer. TCPP-kulene viste seg å være stabile etter lagring i kjøleskap i 300 dager.
Introduction
Porfyriner har vært av interesse i mange år i det biomedisinske feltet på grunn av deres fluorescens og tumormålrettede egenskaper 1,2,3. Terapeutiske anvendelser som fotodynamisk terapi (PDT) og sonodynamisk terapi (SDT) medfører systemisk administrering av porfyrin til en kreftpasient, akkumulering av legemidlet i svulsten og lokalisert eksponering av svulsten til et laserlys med en bestemt bølgelengde eller ultralyd. Eksponeringen for laserlys eller ultralyd fører til generering av reaktive oksygenarter ved porfyrin og påfølgende celledød 4,5. Ved fotodynamisk diagnose (PDD) brukes porfyrinfluorescens for å skille kreftceller fra normale celler6. I denne sammenheng brukes protoporfyrin IX, et naturlig fluorescerende porfyrin som akkumuleres i svulster ved systemisk eller lokal injeksjon av forløperen, 5-aminolevulinsyre (5-ALA), til å identifisere gastrointestinale stromale svulster, blærekreft og hjernekreft 7,8. Mer nylig ble 5-ALA-behandling utforsket som en tilnærming for å oppdage minimal gjenværende sykdom i myelomatose9. Vårt laboratorium har brukt tetraaryl porfyrin TCPP (5,10,15,20-tetrakis-(4-karboksyphenyl)-21,23H-porfin) for sin evne til selektivt å flekke lungekreftceller og kreftassosierte celler i humane sputumprøver, som er en egenskap som har blitt utnyttet i lysbildebaserte og flowcytometriske diagnostiske analyser10.
Noen porfyriner er bifunksjonelle ved at de kan brukes som terapeutiske og diagnostiske midler 2,11. I biomedisinsk forskning brukes slike bifunksjonelle porfyriner til å evaluere hvordan deres evne til selektivt å målrette og drepe kreftceller er en funksjon av deres struktur, samt hvordan den påvirkes av tilstedeværelsen av andre forbindelser 12,13,14,15,16. Både det cellulære opptaket av porfyriner og deres cytotoksisitet kan måles på en flowcytometrisk plattform på en gjennomstrømningsmåte. Absorpsjons- og utslippsspektrene til fluorescerende porfyriner er komplekse, men de fleste flowcytometriske plattformer er utstyrt for å identifisere dem riktig. Absorpsjonsspekteret av fluorescerende porfyriner er preget av et sterkt absorpsjonsbånd i 380-500 nm-området, kjent som Soret-båndet. To til fire svakere absorpsjonsbånd observeres generelt i området 500-750 nm (Q-bånd)17. En blå 488 nm laser, tilstede i de fleste strømningscytometre, eller en fiolett laser (405 nm) kan generere lys med riktig bølgelengde for å opphisse porfyriner. Emisjonsspektrene til porfyriner viser vanligvis topper i området 600-800 nm18, noe som resulterer i svært lite spektral overlapping med fluoresceinisotiocyanat eller phycoerythrin (PE) fluoroforer, men betydelig overlapping med andre ofte brukte fluoroforer, som allophycocyanin (APC), samt tandemfluoroforer, som PE-Cy5 og andre. Derfor, når du bruker porfyriner i flerfargede flowcytometrianalyser, er enkeltfluoroforkontroller avgjørende for å korrigere sølet av fluorescens i andre kanaler enn den som er utpekt til å måle porfyrinens fluorescens.
Ideelt sett bør enkeltfluoroforkontrollene som brukes til å beregne spillovermatrisen for et panel av fluoroforer (også kalt “kompensasjonskontroller”) bestå av samme celletype (er) som prøven. Det er imidlertid ikke optimalt å bruke utvalget til dette formålet hvis det er svært lite utvalg i utgangspunktet, eller hvis målpopulasjonen i utvalget er svært liten (for eksempel hvis man ønsker å se på minimal restsykdom eller kreftceller i de tidlige stadiene av sykdommen). Et nyttig alternativ til celler er perler kombinert med samme fluorofor som brukes til å analysere prøven. Mange slike perler er kommersielt tilgjengelige; Disse kulene er enten forhåndsmerket med ønsket fluorofor (forhåndsmerkede fluoroforspesifikke perler)19,20, eller et fluorescerende merket antistoff kan festes til dem (antistofffangstperler)20,21. Mens kommersielle kompensasjonsperler er tilgjengelige for mange fluoroforer, er slike perler utilgjengelige for porfyriner, til tross for deres økende bruk i grunnleggende og klinisk forskning.
I tillegg til prøvebevaring og passende størrelse positive versus negative populasjoner, er de andre fordelene ved å bruke perler som kompensasjonskontroller enkel forberedelse, lav bakgrunnsfluorescens og utmerket stabilitet over tid22. Den potensielle ulempen ved å bruke perler som kompensasjonskontroll er at utslippsspekteret til det fluorescerende antistoffet fanget på perler kan avvike fra det samme antistoffet som brukes til å merke cellene. Dette kan være av spesiell betydning ved bruk av spektralstrømningscytometer20. Derfor må utviklingen av perler som kompensasjonskontroll utføres på strømningscytometeret som skal brukes til analysen som perlene utvikles for. Videre må utviklingen av perlene inkludere en sammenligning med celler merket med samme fluorescerende fargereagens.
Her beskriver vi fremstillingen av TCPP-aminfunksjonaliserte polystyrenkompensasjonsperler, hvis median fluorescensintensitet i deteksjonskanalen var sammenlignbar med TCPP-merkede celler i sputum, og deres bruk som kompensasjonskontroller for flowcytometri. Autofluorescensen av ekvivalente, ikke-funksjonaliserte perler var tilstrekkelig lav til at de kunne brukes som negative fluorescenskompensasjonskontroller. I tillegg viste disse perlene stabilitet i lagring i nesten 1 år.
Protocol
Representative Results
Discussion
Til tross for de mange anvendelsene av porfyriner i kreftdiagnose og terapeutikk2, er det begrenset litteratur om deres potensielle bruk som et flowcytometrisk reagens for identifisering av kreftpopulasjoner versus ikke-kreftcellepopulasjoner i primært humant vev24,25,26. Vår forskning på flowcytometrisk analyse av humant sputum24,27 krever far…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker David Rodriguez for hjelp med figurforberedelse og Precision Pathology Services (San Antonio, TX) for bruken av Navios EX flowcytometer.
Materials
| Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene | Research Products International | ZC1028-500 | |
| Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 μm diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead | Spherotech | APX-100-10 | Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead |
| Conical tubes, 50 mL, Falcon | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Centrifuge | with appropriate rotor | ||
| Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mL | Fisher Scientific | 09-761-140 | |
| EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N'- ethylcarbodiimide hydrochloride), ≥98% | Sigma | 03450-1G | CAS No: 25952-53-8 |
| FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1) | BD | ||
| Glass coverslips, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-540-BP | |
| Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 µm, 13 mm diameter) | Thomas Scientific | 1190M60 | |
| Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mm | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | 14-175-095 | |
| Isopropanol, ACS grade | Fisher Scientific | AC423830010 | |
| Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tips | Eppendorf | 3123000918 | |
| MES (22- (N- mopholino)- N'- ethanesulfonic acid, hemisodium salt | Sigma | M0164 | CAS No: 117961-21-4 |
| Navios EX flow cytometer | Beckman Coulter | ||
| Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens software | Olympus | or similar | |
| Pasteur pipettes, glass, 5.75" | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| pH meter (UB 10 Ultra Basic) | Denver Instruments | ||
| Pipette controller (Drummond) | Pipete.com | DP101 | |
| Plastic Syringe, 5 mL | Fisher Scientific | 14955452 | |
| Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO, 2.5% w/v, 8.0-12.9 µm | Spherotech | PP-100-10 | |
| Polypropylene tubes, 15mL, conical | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Polystyrene tubes, round bottom | Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K) | Fisher Scientific | NC9207381 | |
| Serological pipettes, disposable – 10 mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Serological pipettes, disposable – 25 mL | Fisher Scientific | 07-200-576 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S6014 | CAS No: 144-55-8 |
| TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine) Frontier Scientific | Fisher Scientific | 50-393-68 | CAS No: 14609-54-2 |
| Tecan Spark Plate Reader (or similar) | Tecan Life Sciences | ||
| Tube revolver/rotator | Thermo Fisher | 88881001 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 |
References
- Josefsen, L. B., Boyle, R. W. Unique diagnostic and therapeutic roles of porphyrins and phthalocyanines in photodynamic therapy, imaging and theranostics. Theranostics. 2 (9), 916-966 (2012).
- Tsolekile, N., Nelana, S., Oluwafemi, O. S. Porphyrin as diagnostic and therapeutic agent. Molecules. 24 (14), 2669 (2019).
- Gunaydin, G., Gedik, M. E., Ayan, S. Photodynamic therapy for the treatment and diagnosis of cancer-A review of the current clinical status. Frontiers in Chemistry. 9, 686303 (2021).
- Berg, K., et al. Porphyrin-related photosensitizers for cancer imaging and therapeutic applications. Journal of Microscopy. 218, 133-147 (2005).
- Kessel, D., Reiners, J. Light-activated pharmaceuticals: Mechanisms and detection). Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 674-680 (2012).
- Didamson, O. C., Abrahamse, H. Targeted photodynamic diagnosis and therapy for esophageal cancer: Potential role of functionalized nanomedicine. Pharmaceutics. 13 (11), 1943 (2021).
- Harada, Y., Murayama, Y., Takamatsu, T., Otsuji, E., Tanaka, H. 5-Aminolevulinic acid-induced protoporphyrin IX fluorescence imaging for tumor detection: Recent advances and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 23 (12), 6478 (2022).
- Bochenek, K., Aebisher, D., Międzybrodzka, A., Cieślar, G., Kawczyk-Krupka, A. Methods for bladder cancer diagnosis – The role of autofluorescence and photodynamic diagnosis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 27, 141-148 (2019).
- Iwaki, K., et al. Flow cytometry-based photodynamic diagnosis with 5-aminolevulinic acid for the detection of minimal residual disease in multiple myeloma. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 249 (1), 19-28 (2019).
- Patriquin, L., et al. Early detection of lung cancer with meso tetra (4-carboxyphenyl) porphyrin-labeled sputum. Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1311-1318 (2015).
- Pan, L., et al. A brief introduction to porphyrin compounds used in tumor imaging and therapies. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 21 (11), 1303-1313 (2021).
- Nishida, K., Tojo, T., Kondo, T., Yuasa, M. Evaluation of the correlation between porphyrin accumulation in cancer cells and functional positions for application as a drug carrier. Scientific Reports. 11 (1), 2046 (2021).
- Lin, Y., Zhou, T., Bai, R., Xie, Y. Chemical approaches for the enhancement of porphyrin skeleton-based photodynamic therapy. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 35 (1), 1080-1099 (2020).
- Kou, J., Dou, D., Yang, L. Porphyrin photosensitizers in photodynamic therapy and its applications. Oncotarget. 8 (46), 81591-81603 (2017).
- Wezgowiec, J., et al. Electric field-assisted delivery of photofrin to human breast carcinoma cells. The Journal of Membrane Biology. 246 (10), 725-735 (2013).
- Palasuberniam, P., et al. Small molecule kinase inhibitors enhance aminolevulinic acid-mediated protoporphyrin IX fluorescence and PDT response in triple negative breast cancer cell lines. Journal of Biomedical Optics. 26 (9), 098002 (2021).
- Kim, B., Bohandy, J. Spectroscopy of porphyrins. Johns Hopkins APL Technical Digest. 2 (3), 153-163 (1981).
- Uttamlal, M., Sheila Holmes-Smith, A. The excitation wavelength dependent fluorescence of porphyrins. Chemical Physics Letters. 454 (4), 223-228 (2008).
- Zhang, Y. Z., Kemper, C., Bakke, A., Haugland, R. P. Novel flow cytometry compensation standards: internally stained fluorescent microspheres with matched emission spectra and long-term stability. Cytometry. 33 (2), 244-248 (1998).
- Monard, S. Building a spectral cytometry toolbox: Coupling fluorescent proteins and antibodies to microspheres. Cytometry. Part A. 101 (10), 846-855 (2022).
- Byrd, T., et al. Polystyrene microspheres enable 10-color compensation for immunophenotyping of primary human leukocytes. Cytometry. Part A. 87 (11), 1038-1046 (2015).
- Roederer, M. Compensation in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , (2002).
- Kabe, Y., et al. Porphyrin accumulation in mitochondria is mediated by 2-oxoglutarate carrier. The Journal of Biological Chemistry. 281 (42), 31729-31735 (2006).
- Bederka, L. H., et al. Sputum analysis by flow cytometry; An effective platform to analyze the lung environment. PLoS One. 17 (8), e0272069 (2022).
- . US6838248B2 – Compositions and methods for detecting pre-cancerous conditions in cell and tissue samples using 5, 10, 15, 20-tetrakis (carboxyphenyl) porphine Available from: https://patents.google.com/patent/US68248B2/en?oq=US+patent+6838248+B2 (2005)
- . Method of using 5,10,15,20-tetrakis(carboxyphenyl)porphine for detecting cancers of the lung Available from: https://www.osti.gov/deopatents/biblio/7117152 (1992)
- Grayson, M., et al. Quality-controlled sputum analysis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (174), e62785 (2021).
- Anjali, K., Christopher, J., Sakthivel, A. Ruthenium-based macromolecules as potential catalysts in homogeneous and heterogeneous phases for the utilization of carbon dioxide. ACS Omega. 4 (8), 13454-13464 (2019).
- Yadav, R., et al. Recent advances in the preparation and applications of organo-functionalized porous materials. Chemistry. 15 (17), 2588-2621 (2020).
- . US7670799B2 – Method for making 5,10,15,10-tetrakis (carboxyphenyl) porphine (TCPP) solutions and composition compromising TCPP Available from: https://patents.google.com/patent/US7670799B2/en (2023)
- Shimizu, N., et al. High-performance affinity beads for identifying drug receptors. Nature Biotechnology. 18 (8), 877-881 (2000).
- Anderson, G. W., Zimmerman, J. E., Callahan, F. M. The use of esters of N-hydroxysuccinimide in peptide synthesis. Journal of the American Chemical Society. 86 (9), 1839-1842 (1964).
- Hermanson, G. T. . Bioconjugate Techniques. , (2013).
- El-Faham, A., Albericio, F. Peptide coupling reagents, more than a letter soup. Chemical Reviews. 111 (11), 6557-6602 (2011).
- Hulspas, R., O’Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry Part B. 76 (6), 355-364 (2009).
- Hoffman, R. A. Standardization, calibration, and control in flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , (2005).
- Ethirajan, M., Chen, Y., Joshi, P., Pandey, R. K. The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy. Chemical Society Reviews. 40 (1), 340-362 (2011).
- Beharry, A. A. Next-generation photodynamic therapy: New probes for cancer imaging and treatment. Biochemistry. 57 (2), 173-174 (2018).
- El-Far, M., Pimstone, N. A comparative study of 28 porphyrins and their abilities to localize in mammary mouse carcinoma: Uroporphyrin I superior to hematoporphyrin derivative. Progress in Clinical and Biological Research. 170, 661-672 (1984).
