Questa tecnica descrive un flusso di lavoro efficace per visualizzare e misurare quantitativamente il potenziale della membrana mitocondriale e i livelli di superossido all’interno delle cellule HeLa utilizzando l’imaging dal vivo basato sulla fluorescenza.
I mitocondri sono organelli dinamici critici per l’omeostasi metabolica controllando la produzione di energia attraverso la sintesi di ATP. Per sostenere il metabolismo cellulare, vari meccanismi di controllo della qualità mitocondriale cooperano per mantenere una rete mitocondriale sana. Uno di questi percorsi è la mitofagia, in cui la chinasi 1 indotta da PTEN (PINK1) e la fosfo-ubiquitinazione parkina dei mitocondri danneggiati facilitano il sequestro dell’autofagosoma e la successiva rimozione dalla cellula tramite fusione del lisosoma. La mitofagia è importante per l’omeostasi cellulare e le mutazioni nel Parkin sono legate alla malattia di Parkinson (PD). A causa di questi risultati, c’è stata un’enfasi significativa sullo studio del danno mitocondriale e del turnover per comprendere i meccanismi molecolari e le dinamiche del controllo di qualità mitocondriale. Qui, l’imaging di cellule vive è stato utilizzato per visualizzare la rete mitocondriale delle cellule HeLa, per quantificare il potenziale della membrana mitocondriale e i livelli di superossido dopo il trattamento con cianuro di carbonile m-clorofenil idrazone (CCCP), un agente di disaccoppiamento mitocondriale. Inoltre, una mutazione PD-linked di Parkin (ParkinT240R) che inibisce la mitofagia Parkin-dipendente è stata espressa per determinare come l’espressione mutante influisce sulla rete mitocondriale rispetto alle cellule che esprimono Parkin wild-type. Il protocollo qui descritto descrive un semplice flusso di lavoro che utilizza approcci basati sulla fluorescenza per quantificare efficacemente il potenziale della membrana mitocondriale e i livelli di superossido.
La rete mitocondriale è una serie di organelli interconnessi che svolgono un ruolo cruciale nella produzione di energia1, nell’immunità innata2,3 e nella segnalazione cellulare 4,5. La disregolazione mitocondriale è stata associata a malattie neurodegenerative come il morbo di Parkinson (PD)6,7. Il PD è una malattia neurodegenerativa progressiva che colpisce i neuroni dopaminergici della substantia nigra che colpisce quasi 10 milioni di persone in tutto il mondo8. Il PD è stato geneticamente collegato alla mitofagia, una via di controllo della qualità mitocondriale necessaria per mantenere l’omeostasi cellulare che rimuove selettivamente i mitocondri danneggiati 9,10. Gli studi hanno identificato molteplici percorsi mitofagici indipendenti, tra cui la mitofagia mediata dal dominio FUN14 contenente 1 (FUNDC1), la mitofagia facilitata dalla proteina 3 interagente Bcl-2 (BNIP3), la mitofagia NIX-dipendente e la ben caratterizzata chinasi 1 (PINK1) / Parkin-regolata mitofagia10,11. PINK1 (una presunta chinasi) e Parkin (una ubiquitina ligasi E3) lavorano in tandem con i mitocondri danneggiati fosfo-ubiquitinati, che guidano la formazione di autofagosomi che inghiottono l’organello danneggiato e si fondono con i lisosomi per avviare la degradazione 12,13,14,15,16. Le mutazioni nel Parkin sono state associate a fenotipi legati alla PD come la neurodegenerazione attraverso la perdita di neuroni dopaminergici17,18.
Qui viene descritto un protocollo in cui le cellule HeLa, cellule immortalizzate utilizzate di routine derivate dal cancro cervicale, vengono utilizzate per studiare il ruolo del Parkin nel mantenimento della salute della rete mitocondriale. Le cellule HeLa esprimono livelli trascurabili di Parkin endogeno e pertanto richiedono l’espressione esogena di Parkina19. Per studiare il ruolo del Parkin nella salute della rete mitocondriale, le cellule HeLa sono trasfettate con Parkin di tipo selvatico (ParkinWT), un mutante Parkin (ParkinT240R) o un vettore di controllo vuoto. ParkinT240R è una mutazione autosomica recessiva del parkinsonismo giovanile che influenza l’attività della parkina E3 ligasi, riducendo significativamente l’efficienza della via mitofagia20. Le cellule HeLa sono soggette a concentrazioni lievi (5 μM) o gravi (20 μM) di cianuro di carbonile m-clorofenil idrazone (CCCP), un agente di disaccoppiamento mitocondriale. Il trattamento con gravi concentrazioni di CCCP viene utilizzato di routine per indurre la mitofagia mediata dal Parkina in varie linee cellulari, come HeLa e le cellule COS-721,22,23.
Dopo il trattamento, il protocollo impiega l’imaging dal vivo della rete mitocondriale utilizzando due coloranti fluorescenti mitocondriali attualmente disponibili. La tetrametilrhodamina, estere etilico, perclorato (TMRE) è un colorante cationico che fluoresce in base al potenziale di membrana mitocondriale24, mentre MitoSOX è un indicatore di superossido mitocondriale in cui l’intensità di fluorescenza è una funzione della concentrazione di superossido25. Infine, il protocollo delineato utilizza una quantificazione basata sulla fluorescenza e un flusso di lavoro semplice per quantificare efficacemente il potenziale della membrana mitocondriale e i livelli di superossido con un margine minimo per i pregiudizi dell’utente. Sebbene questo protocollo sia stato progettato per studiare la funzione mitocondriale nelle cellule HeLa, può essere adattato per ulteriori linee cellulari e tipi di cellule primarie per caratterizzare quantitativamente la salute della rete mitocondriale.
Il flusso di lavoro qui descritto può essere utilizzato per quantificare il potenziale della membrana mitocondriale e i livelli di superossido in modo robusto e riproducibile utilizzando l’imaging basato sulla fluorescenza30. Ci sono importanti limitazioni tecniche da considerare quando si progettano questi esperimenti. Le cellule HeLa sono state trasfettate con un vettore YFP vuoto, YFP-ParkinWT o YFP-ParkinT240R. Il vettore YFP vuoto è stato utilizzato come controllo per …
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo i membri del laboratorio Evans per il loro attento feedback su questo manoscritto. Questo lavoro è supportato da Duke Whitehead Scholars, Duke Science and Technology Scholars e Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Hanna Gray Fellowship. La Figura 1A è stata realizzata utilizzando BioRender.com.
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone) | Sigma-Aldrich | C2759 | |
DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose | Gibco | 11-965-084 | |
DMSO, Anhydrous | ThermoFisher Scientific | D12345 | |
Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007103 | |
FuGENE 6 (Tranfection Reagent) | Promega | E2691 | |
GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution) | Gibco | 35-050-061 | |
Hoescht 33342 | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
MitoSOX Red | ThermoFisher Scientific | M36008 | |
MitoTracker Deep Red | ThermoFisher Scientific | M7514 | |
Opti-MEM (Redued Serum media) | ThermoFisher scientific | 31985070 | |
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) | ThermoFisher Scientific | T669 | |
Experimental models: Organisms/Strains | |||
HeLa-M (Homo sapiens) | A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research) | N/A | |
Recombinant DNA | |||
EYFP Empty Vector | N/A | N/A | |
YFP-Parkin T240R | This Paper | Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin | |
YFP-Parkin WT | Addgene; PMID:19029340 | RRID:Addgene_23955 | |
Software and Algorithms | |||
Adobe Illustrator | Adobe Inc. | https://www.adobe.com/products/illustrator | (Schindelin, 2012) |
Excel (Spreadsheet Software) | Microsoft Office | https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel | |
ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
Leica Application Suite (LAS X) | Leica | https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/ | |
Microsoft Excel | Microsoft Office | https://www.microsoft.com/excel | |
Prism9 (Statistical Analysis Software) | GraphPad Software | https://www.graphpad.com | |
Other | |||
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
Cage Incubator (Environmental Chamber) | Okolab | https://www.oko-lab.com/cage-incubator | |
DMiL Inverted Microscope | Leica | N/A | |
LIGHTNING Deconvolution Software | Leica | N/A | |
STELLARIS 8 confocal microscope | Leica | N/A |