Denna teknik beskriver ett effektivt arbetsflöde för att visualisera och kvantitativt mäta mitokondriell membranpotential och superoxidnivåer i HeLa-celler med hjälp av fluorescensbaserad levande avbildning.
Mitokondrier är dynamiska organeller som är kritiska för metabolisk homeostas genom att kontrollera energiproduktionen via ATP-syntes. För att stödja cellulär metabolism samarbetar olika mitokondriella kvalitetskontrollmekanismer för att upprätthålla ett hälsosamt mitokondriellt nätverk. En sådan väg är mitofagi, där PTEN-inducerat kinas 1 (PINK1) och Parkin-fosfo-ubiquitinering av skadade mitokondrier underlättar autofagosombindning och efterföljande avlägsnande från cellen via lysosomfusion. Mitophagy är viktigt för cellulär homeostas, och mutationer i Parkin är kopplade till Parkinsons sjukdom (PD). På grund av dessa fynd har det lagts stor vikt vid att undersöka mitokondriella skador och omsättning för att förstå de molekylära mekanismerna och dynamiken i mitokondriell kvalitetskontroll. Här användes levande cellavbildning för att visualisera det mitokondriella nätverket av HeLa-celler, för att kvantifiera mitokondriell membranpotential och superoxidnivåer efter behandling med karbonylcyanid m-klorfenylhydrazon (CCCP), ett mitokondriellt frikopplingsmedel. Dessutom uttrycktes en PD-länkad mutation av Parkin (ParkinT240R) som hämmar Parkin-beroende mitofagi för att bestämma hur mutantuttryck påverkar mitokondriellt nätverk jämfört med celler som uttrycker Parkin av vildtyp. Protokollet som beskrivs här beskriver ett enkelt arbetsflöde med fluorescensbaserade metoder för att kvantifiera mitokondriell membranpotential och superoxidnivåer effektivt.
Mitokondriellt nätverk är en serie sammankopplade organeller som spelar en avgörande roll i energiproduktion1, medfödd immunitet2,3 och cellsignalering 4,5. Mitokondriell dysreglering har associerats med neurodegenerativa sjukdomar som Parkinsons sjukdom (PD)6,7. PD är en progressiv neurodegenerativ sjukdom som påverkar dopaminerga neuroner i substantia nigra som påverkar nästan 10 miljoner människor världen över8. PD har varit genetiskt kopplad till mitofagi, en mitokondriell kvalitetskontrollväg som är nödvändig för att upprätthålla cellulär homeostas som selektivt tar bort skadade mitokondrier 9,10. Studier har identifierat flera oberoende mitofagivägar, inklusive FUN14-domän innehållande 1 (FUNDC1)-medierad mitofagi, Bcl-2-interagerande protein 3 (BNIP3)-underlättad mitofagi, NIX-beroende mitofagi och det välkarakteriserade PTEN-inducerade kinas 1 (PINK1)/Parkin-reglerade mitofagi10,11. PINK1 (ett förmodat kinas) och Parkin (ett E3 ubiquitinligas) arbetar tillsammans för att fosfo-ubiquitinatskadade mitokondrier, vilket driver bildandet av autofagosomer som uppslukar den skadade organellen och smälter samman med lysosomer för att initiera nedbrytning 12,13,14,15,16. Mutationer i Parkin har associerats med PD-länkade fenotyper såsom neurodegeneration via förlust av dopaminerga neuroner17,18.
Här beskrivs ett protokoll där HeLa-celler, rutinmässigt använda odödliga celler härrörande från livmoderhalscancer, används för att undersöka Parkins roll för att upprätthålla mitokondriell nätverkshälsa. HeLa-celler uttrycker försumbara nivåer av endogent Parkin och kräver därför exogent Parkin-uttryck19. För att studera Parkins roll i mitokondriell nätverkshälsa transfekteras HeLa-celler med antingen vildtyp Parkin (ParkinWT), en Parkin-mutant (ParkinT240R) eller en tom kontrollvektor. ParkinT240R är en autosomalt recessiv juvenil parkinsonismmutation som påverkar Parkin E3-ligasaktiviteten, vilket avsevärt minskar effektiviteten hos mitofagivägen20. HeLa-celler utsätts för milda (5 μM) eller svåra (20 μM) koncentrationer av karbonylcyanid m-klorfenylhydrazon (CCCP), ett mitokondriellt frikopplingsmedel. Behandling med svåra koncentrationer av CCCP används rutinmässigt för att inducera parkinmedierad mitofagi i olika cellinjer, såsom HeLa- och COS-7-celler21,22,23.
Efter behandling använder protokollet levande avbildning av mitokondriellt nätverk med hjälp av två för närvarande tillgängliga mitokondriella riktade fluorescerande färgämnen. Tetrametylrodamin, etylester, perklorat (TMRE) är ett katjoniskt färgämne som fluorescerar baserat på mitokondriell membranpotential24, medan MitoSOX är en mitokondriell superoxidindikator där fluorescensintensiteten är en funktion av superoxidkoncentrationen25. Slutligen använder det skisserade protokollet en fluorescensbaserad kvantifiering och ett enkelt arbetsflöde för att effektivt kvantifiera mitokondriell membranpotential och superoxidnivåer med minimalt utrymme för användarbias. Även om detta protokoll utformades för att studera mitokondriell funktion i HeLa-celler, kan det anpassas för ytterligare cellinjer och primära celltyper för att kvantitativt karakterisera mitokondriell nätverkshälsa.
Arbetsflödet som beskrivs här kan användas för att kvantifiera mitokondriell membranpotential och superoxidnivåer robust och reproducerbart med hjälp av fluorescensbaserad avbildning30. Det finns viktiga tekniska begränsningar att tänka på när du utformar dessa experiment. HeLa-celler transfekterades med en tom YFP-vektor, YFP-ParkinWT eller YFP-ParkinT240R. Den tomma YFP-vektorn användes som en kontroll för att bekräfta att experimentella fynd var specifika för…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar medlemmarna i Evans labb för deras tankeväckande feedback på detta manuskript. Detta arbete stöds av Duke Whitehead Scholars, Duke Science and Technology Scholars och Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Hanna Gray Fellowship. Figur 1A gjordes med hjälp av BioRender.com.
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone) | Sigma-Aldrich | C2759 | |
DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose | Gibco | 11-965-084 | |
DMSO, Anhydrous | ThermoFisher Scientific | D12345 | |
Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007103 | |
FuGENE 6 (Tranfection Reagent) | Promega | E2691 | |
GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution) | Gibco | 35-050-061 | |
Hoescht 33342 | ThermoFisher Scientific | 62249 | |
MitoSOX Red | ThermoFisher Scientific | M36008 | |
MitoTracker Deep Red | ThermoFisher Scientific | M7514 | |
Opti-MEM (Redued Serum media) | ThermoFisher scientific | 31985070 | |
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) | ThermoFisher Scientific | T669 | |
Experimental models: Organisms/Strains | |||
HeLa-M (Homo sapiens) | A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research) | N/A | |
Recombinant DNA | |||
EYFP Empty Vector | N/A | N/A | |
YFP-Parkin T240R | This Paper | Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin | |
YFP-Parkin WT | Addgene; PMID:19029340 | RRID:Addgene_23955 | |
Software and Algorithms | |||
Adobe Illustrator | Adobe Inc. | https://www.adobe.com/products/illustrator | (Schindelin, 2012) |
Excel (Spreadsheet Software) | Microsoft Office | https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel | |
ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
Leica Application Suite (LAS X) | Leica | https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/ | |
Microsoft Excel | Microsoft Office | https://www.microsoft.com/excel | |
Prism9 (Statistical Analysis Software) | GraphPad Software | https://www.graphpad.com | |
Other | |||
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
Cage Incubator (Environmental Chamber) | Okolab | https://www.oko-lab.com/cage-incubator | |
DMiL Inverted Microscope | Leica | N/A | |
LIGHTNING Deconvolution Software | Leica | N/A | |
STELLARIS 8 confocal microscope | Leica | N/A |