कंकाल की मांसपेशी उत्तेजना का अध्ययन करने के लिए मूल कोशिकाओं में कार्यात्मक साइट-निर्देशित फ्लोरोमेट्री
Summary
कार्यात्मक साइट-निर्देशित फ्लोरोमेट्री वास्तविक समय में प्रोटीन डोमेन गति का अध्ययन करने की एक विधि है। देशी कोशिकाओं में इसके आवेदन के लिए इस तकनीक का संशोधन अब मुराइन पृथक कंकाल मांसपेशी फाइबर में वोल्टेज-गेटेड सीए2 + चैनलों से एकल वोल्टेज-सेंसर गति का पता लगाने और ट्रैकिंग की अनुमति देता है।
Abstract
कार्यात्मक साइट-निर्देशित फ्लोरोमेट्री वोल्टेज-गेटेड आयन चैनलों सहित कई झिल्ली प्रोटीनों की संरचना-कार्य संबंध की जांच करने के लिए पसंद की तकनीक रही है। इस दृष्टिकोण का उपयोग मुख्य रूप से हेटरोलॉगस अभिव्यक्ति प्रणालियों में झिल्ली धाराओं को एक साथ मापने, चैनलों की गतिविधि की विद्युत अभिव्यक्ति और प्रतिदीप्ति माप, स्थानीय डोमेन पुनर्व्यवस्था की रिपोर्ट करने के लिए किया गया है। कार्यात्मक साइट-निर्देशित फ्लोरोमेट्री इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, आणविक जीव विज्ञान, रसायन विज्ञान और प्रतिदीप्ति को एक विस्तृत तकनीक में जोड़ती है जो क्रमशः प्रतिदीप्ति और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के माध्यम से वास्तविक समय संरचनात्मक पुनर्व्यवस्था और कार्य के अध्ययन की अनुमति देती है। आमतौर पर, इस दृष्टिकोण के लिए एक इंजीनियर वोल्टेज-गेटेड झिल्ली चैनल की आवश्यकता होती है जिसमें एक सिस्टीन होता है जिसे थिओल-प्रतिक्रियाशील फ्लोरोसेंट डाई द्वारा परीक्षण किया जा सकता है। हाल तक, प्रोटीन के साइट-निर्देशित फ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले थिओल-प्रतिक्रियाशील रसायन विज्ञान को विशेष रूप से जेनोपस अंडाणुओं और सेल लाइनों में किया गया था, जो प्राथमिक गैर-उत्तेजक कोशिकाओं के दृष्टिकोण के दायरे को सीमित करता है। यह रिपोर्ट उत्तेजना-संकुचन युग्मन के शुरुआती चरणों का अध्ययन करने के लिए वयस्क कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं में कार्यात्मक साइट-निर्देशित फ्लोरोमेट्री की प्रयोज्यता का वर्णन करती है, जिस प्रक्रिया द्वारा मांसपेशी फाइबर विद्युत विध्रुवण मांसपेशियों के संकुचन के सक्रियण से जुड़ा होता है। वर्तमान प्रोटोकॉल विवो इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग करके वयस्क चूहों के फ्लेक्सर डिजिटोरम ब्रेविस के मांसपेशी फाइबर में सिस्टीन-इंजीनियर ्ड वोल्टेज-गेटेड सीए2 + चैनलों (सीएवी1.1) को डिजाइन और स्थानांतरित करने के तरीकों का वर्णन करता है और कार्यात्मक साइट-निर्देशित फ्लोरोमेट्री माप के लिए आवश्यक बाद के चरणों का वर्णन करता है। इस दृष्टिकोण को अन्य आयन चैनलों और प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। स्तनधारी मांसपेशियों के कार्यात्मक साइट-निर्देशित फ्लोरोमेट्री का उपयोग उत्तेजना के बुनियादी तंत्र का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है।
Introduction
एक जीवित कोशिका में एक ज्ञात विद्युत उत्तेजना के जवाब में आयन चैनल विरूपण पुनर्व्यवस्था को ट्रैक करने की क्षमता आणविक शरीर विज्ञान1 के लिए मूल्यवान जानकारी का एक स्रोत है। वोल्टेज-गेटेड आयन चैनल झिल्ली प्रोटीन होते हैं जो ट्रांसमेम्ब्रेन वोल्टेज में परिवर्तन को महसूस करते हैं, और उनका कार्य वोल्टेज परिवर्तन2 से भी प्रभावित होता है। पिछली शताब्दी में वोल्टेज क्लैंप तकनीकों के विकास ने फिजियोलॉजिस्ट को वास्तविक समय में, झिल्ली विध्रुवण 3 के जवाब में वोल्टेज-गेटेड आयन चैनलों द्वारा किए गए आयनिक धाराओं का अध्ययन करने की अनुमतिदी। वोल्टेज क्लैंप तकनीक का उपयोग न्यूरॉन्स और मांसपेशियों जैसे उत्तेजक कोशिकाओं के विद्युत गुणों को समझने में महत्वपूर्ण रहा है। 1970 के दशक में, वोल्टेज क्लैंप शोधन ने वोल्टेज-गेटेड कैल्शियम (सीएवी) और सोडियम (एनएवी) चैनलों 4,5 में गेटिंग धाराओं (या चार्ज मूवमेंट) का पता लगाने की अनुमति दी। गेटिंग धाराएं गैर-रैखिक कैपेसिटिव धाराएं हैं जो कोशिका झिल्ली6 में विद्युत क्षेत्र में परिवर्तन के जवाब में वोल्टेज सेंसर की गति से उत्पन्न होती हैं। गेटिंग धाराओं को आणविक पुनर्व्यवस्था का एक विद्युत अभिव्यक्ति माना जाता है जो आयन चैनल खोलने से पहले या उसके साथहोता है। जबकि ये वर्तमान माप चैनल के कार्य के बारे में मूल्यवान जानकारी प्रदान करते हैं, आयनिक धाराएं और गेटिंग धाराएं दोनों वोल्टेज-गेटेडचैनलों के अंतर-और अंतर-आणविक विरूपण पुनर्व्यवस्था के अप्रत्यक्ष रीडआउट हैं।
कार्यात्मक साइट-निर्देशित फ्लोरोमेट्री (एफएसडीएफ; जिसे वोल्टेज क्लैंप फ्लोरोमेट्री, वीसीएफ के रूप में भी जाना जाता है) 1990के दशक की शुरुआत में विकसित किया गया था और पहली बार, स्थानीय विरूपण परिवर्तनों और वास्तविक समय में एक चैनल प्रोटीन के कार्य को सीधे देखने की क्षमता प्रदान की गई थी। चैनल म्यूटेनेसिस, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और हेटरोलॉगस अभिव्यक्ति प्रणालियों के संयोजन का उपयोग करके, सक्रिय उत्तेजना 9,10 के जवाब में विशिष्ट चैनलों या रिसेप्टर्स के चलती भागों को फ्लोरोसेंटली टैग और ट्रैक करना संभव है। वोल्टेज-गेटेडआयन चैनलों 8,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 में वोल्टेज-सेंसिंग तंत्र का अध्ययन करने के लिए इस दृष्टिकोण का बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है। आधिकारिक समीक्षाओं के लिए, 10,20,21,22,23 देखें।
विद्युत संकेतों की शुरुआत और प्रसार के लिए महत्वपूर्ण सीए वी और एनएवी चैनल एक मुख्य ए 1 सबयूनिट से बने होते हैं, जिसमें एक केंद्रीय छिद्र और चार गैर-समान वोल्टेज सेंसिंग डोमेनहोते हैं। उनकी विशिष्ट प्राथमिक संरचना के अलावा, सीए वी और एनएवी चैनलों को सहायक सबयूनिट्स24 के साथ मल्टीसबयूनिट कॉम्प्लेक्स के रूप में व्यक्त किया जाता है। वोल्टेज-निर्भर पोटेशियम चैनल (के वी) में चार सबयूनिट होते हैं जो एनए वी या सीएवी25 के एकल डोमेन की तरह दिखते हैं। सीएवी और एनएवी चैनलों के छिद्र बनाने और वोल्टेज-सेंसिंग ए 1 सबयूनिट का गठन छह अद्वितीय ट्रांसमेम्ब्रेन खंडों (एस 1-एस 6) के चार अलग-अलग डोमेन के लिए एक एकल पॉलीपेप्टाइड कोडिंग द्वारा किया जाता है। चित्र 1ए)। 24,26. एस 1 से एस 4 ट्रांसमेम्ब्रेन खंडों से युक्त क्षेत्र वोल्टेज सेंसिंग डोमेन (वीएसडी) बनाते हैं और एस 5 और एस 6 ट्रांसमेम्ब्रेन सेगमेंट पोर डोमेन26 बनाते हैं। प्रत्येक वीएसडी में, एस 4 α-हेलिक्स में सकारात्मक रूप से चार्ज आर्जिनिन या लाइसिन (चित्रा 1 ए, बी) होता है जो झिल्ली विध्रुवण7 के जवाब में चलता है। कई दशकों के शोध और अत्यधिक विविध प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों के परिणाम इस आधार का समर्थन करते हैं कि झिल्ली विध्रुवण6 के जवाब में एस 4 खंड बाहर की ओर बढ़ते हैं, गेटिंग धाराएं उत्पन्न करते हैं।
एफएसडीएफ एक आयन चैनल या अन्य प्रोटीन पर एक विशिष्ट सिस्टीन अवशेष (यानी, एस 4 α-हेलिक्स) से संयुग्मित थिओल-प्रतिक्रियाशील डाई के प्रतिदीप्ति परिवर्तनों को मापता है, जिसे साइट-निर्देशित म्यूटेनेसिस के माध्यम से इंजीनियर किया जाता है, क्योंकि चैनल झिल्ली विध्रुवण या अन्य उत्तेजनाओं के जवाब में कार्य करताहै। वास्तव में, एफएसडीएफ को मूल रूप से यह जांचने के लिए विकसित किया गया था कि क्याकेवी चैनलों में एस 4 खंड, जिसे चैनल का मुख्य वोल्टेज सेंसर होने का प्रस्ताव है, तब चलता है जब झिल्ली क्षमता 8,10 में परिवर्तन के जवाब में गेटिंग चार्ज चलते हैं। वोल्टेज-गेटेड आयन चैनलों के मामले में, एफएसडीएफ चैनल फ़ंक्शन माप के साथ समवर्ती रूप से चार वीएसडी (किसी भी समय एक वीएसडी को ट्रैक करना) के स्वतंत्र विरूपण पुनर्व्यवस्था को हल कर सकता है। दरअसल, इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, यह दिखाया गया है कि व्यक्तिगत वीएसडी चैनल सक्रियण और निष्क्रियता 12,27,28,29,30 के विशिष्ट पहलुओं में अलग-अलग शामिल दिखाई देते हैं। चैनलों के कार्य में प्रत्येक वीएसडी के योगदान की पहचान करना उच्च प्रासंगिकता का है और इसका उपयोग चैनल संचालन को और स्पष्ट करने और संभावित रूप से दवा विकास के लिए नए लक्ष्यों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है।
हेटरोलॉगस अभिव्यक्ति प्रणालियों में एफएसडीएफ का उपयोग एक न्यूनीकरणवादी परिप्रेक्ष्य10,23 से चैनल फ़ंक्शन की हमारी समझ को आगे बढ़ाने में बेहद सहायक रहा है। कई न्यूनीकरणवादी दृष्टिकोणों की तरह, यह फायदे प्रस्तुत करता है लेकिन इसकी सीमाएं भी हैं। उदाहरण के लिए, एक प्रमुख सीमा हेटरोलॉगस सिस्टम में चैनल नैनो पर्यावरण का आंशिक पुनर्गठन है। अक्सर, आयन चैनल कई सहायक सबयूनिट्स और कई अन्य प्रोटीनों के साथ बातचीत करते हैं जो उनके फ़ंक्शनको संशोधित करते हैं। सिद्धांत रूप में, विभिन्न चैनलों और उनके सहायक सबयूनिट्स को कई प्रोटीन कोडिंग संरचनाओं या पॉलीसिस्ट्रोनिक प्लास्मिड के उपयोग के साथ हेटरोलॉगस सिस्टम में व्यक्त किया जा सकता है, लेकिन उनके मूल वातावरण को पूरी तरहसे पुनर्गठित नहीं किया जा सकता है।
हमारे समूह ने हाल ही में उत्तेजना-संकुचन युग्मन (ईसीसी) 33,34 के शुरुआती चरणों के अध्ययन के लिए देशी विघटित कंकाल की मांसपेशी फाइबर में एफएसडीएफ का एक संस्करण प्रकाशित किया, जिस प्रक्रिया द्वारा मांसपेशी फाइबर विद्युत विध्रुवण मांसपेशियों के संकुचन35,36 के सक्रियण से जुड़ा हुआ है। पहली बार, इस दृष्टिकोण ने एक वयस्क विभेदित मांसपेशी फाइबर37 के मूल वातावरण में वोल्टेज-गेटेड एल-टाइप सीए2 + चैनल (सीएवी1.1, जिसे डीएचपीआर भी कहा जाता है) से व्यक्तिगत एस 4 वोल्टेज-सेंसर की गति ट्रैकिंग की अनुमति दी। यह इस सेल प्रकार की कई विशेषताओं पर विचार करके पूरा किया गया था, जिसमें सेल की विद्युत गतिविधि तेजी से उत्तेजना-प्रेरित स्व-प्रचारित विध्रुवण की अनुमति देती है, विवो इलेक्ट्रोपोरेशन के माध्यम से सीडीएनए प्लास्मिड को व्यक्त करने की क्षमता, सेल के भीतर चैनलों की प्राकृतिक उच्च अभिव्यक्ति और कंपार्टमेंटल संगठन, और उच्च गति इमेजिंग और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग उपकरणों के साथ इसकी संगतता शामिल है। पहले, हमने एक पता लगाने वाले डिवाइस37 के रूप में एक हाई-स्पीड लाइन स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग किया था। अब, सिग्नल अधिग्रहण के लिए फोटोडायोड का उपयोग करके तकनीक की एक भिन्नता प्रस्तुत की जाती है। यह फोटोडायोड-आधारित पहचान प्रणाली अन्य प्रयोगशालाओं में इस तकनीक के कार्यान्वयन की सुविधा प्रदान कर सकती है।
यहां, सीएवी1.1 से व्यक्तिगत वोल्टेज-सेंसर आंदोलन के अध्ययन के लिए देशी कोशिकाओं में एफएसडीएफ का उपयोग करने के लिए एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल वर्णित है। जबकि सीएवी1.1 चैनल का उपयोग इस पांडुलिपि में एक उदाहरण के रूप में किया गया है, इस तकनीक को अन्य आयन चैनलों, रिसेप्टर्स या सतह प्रोटीन के बाह्य रूप से सुलभ डोमेन पर लागू किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, सीएवी1.1 चैनल से व्यक्तिगत वोल्टेज सेंसर गति के अध्ययन के लिए मांसपेशी फाइबर में एफएसडीएफ का संचालन करने के लिए एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। भले ही इस तकनीक में संयुक्त चरणों क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
वेरगारा (कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, लॉस एंजिल्स) को ईजीएफपी-सीएवी1.1 (खरगोश) जंगली प्रकार के प्लास्मिड को साझा करने के लिए धन्यवाद देते हैं। हम ट्रैक और होल्ड सर्किट के साथ फोटोडायोड के डिजाइन और निर्माण के लिए फिजियोलॉजी इलेक्ट्रॉनिक्स प्रयोगशाला के येल विभाग और विशेष रूप से हेनरिक एबिल्डगार्ड को धन्यवाद देते हैं। इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थान आर01-AR075726 और आर01-NS103777 द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Hyaluronidase | SIGMA ALDRICH | H3884-50mg | |
| 0.5 mL Eppendorf tube | Millipore Sigma | EP022363719-500EA | |
| 1 mL syringe | Millipore Sigma | Z683531-100EA | tuberculine slip tip |
| 1/2” long 29-gauge sterile insulin needle and syringe | Becton Dikinson | 324702 | |
| 35 mm non coated plastic plate | Falcon, Corning | 353001 | |
| 60 mm non coated plastic plate | Falcon, Corning | 351007 | |
| Alcoholic whip | PDI | B60307 | |
| Alexa-533 cube LP | Chroma | 49907 | Ex: 530/30x; BS: 532; Em: 550lp |
| Arc lamp | Sutter Instrumets | LB-LS 672 | |
| Artificial tears cream | Akorn | NDC 59399-162-35 | |
| Borosilicate glass Pasteur pipet 5 3/4" | VWR | 14672-200 | |
| BTS (N-benzyl-p-toluene sulphonamide) | SIGMA ALDRICH | 203895 | |
| collagenase type I | SIGMA ALDRICH | C0130-1g | |
| Cotton tip | VWR | VWR-76048-960-BG | |
| Double electrode array (for electroporation) | BTX harvard apparatus | 45-0120 | 10mm 2 needle array tips |
| EGFP cube | Chroma | 39002AT | Ex: 480/30x; BS 505; Em: 535/40m |
| Electroporation apparatus device | BTX harvard apparatus | ECM 830 | |
| EPC10 | HEKA Elektronik GmbH (Harvard Bioscience) | 895000 | |
| FBS | Biotechne, R&D Systems | RND-S11150H | Fetal Bovine Serum – Premium, Heat Inactivated |
| glass coverslip 35 mm dish | MatTek Life Science | P35G-1.5-14-C | |
| Isoflurane | Fluriso (Isoflurane) Liquid for Inhalation | 502017-250ml | |
| Isothermal heating pad | Braintree scientific inc | 39DP | |
| Laminin | Thermo Fisher | INV-23017015 | Laminin Mouse Protein, Natural |
| Latex bulb | VWR | 82024-554 | |
| LED 530 nm | Sutter Instrumets | 5A-530 | |
| Low binding protein 0.2 μm sterile filter | Pall | FG4579 | acrodisk syringe filter 0.2um supor membrane low protein binding non pyrogenic |
| MEM | Invitrogen | INV-11380037 | |
| MTS-5-TAMRA | Biotium | 89410-784 | MTS-5-TAMRA |
| OriginPro Analysis Software | OriginLab Corporation | OriginPro 2022 (64-bit) SR1 | |
| Photodiode | Custom Made | NA | |
| PlanApo 60x oil 1.4 N.A/∞/0.17 | Olympus | BFPC2 | |
| Platinum wire 0.5 mm, 99.9 % metals basis | SIGMA | 267228-1G | To manufacyte field stimulation electrode |
| Pulse Generator | WPI | Pulsemaster A300 | |
| Shutter drive controller | Uniblitz | 100-2B | |
| Shuttter | Uniblitz | VS2582T0-100 | |
| S-MEM | Invitrogen | INV-11380037 | |
| Sterile bench pad | VWR | DSI-B1623 | |
| Sterile saline | SIGMA ALDRICH | S8776 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer kit | Dow Corning | 1419447-1198 | |
| Vaporizer for Anesthesia | Parkland Scientific | V3000PK | |
| Voltage generator | Custom Made | NA |
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