Fluorometria Sítio-Dirigida Funcional em Células Nativas para Estudo da Excitabilidade do Músculo Esquelético

Summary

A fluorometria sítio-dirigida funcional é um método para estudar movimentos do domínio de proteínas em tempo real. A modificação desta técnica para sua aplicação em células nativas agora permite a detecção e rastreamento de movimentos de sensores de voltagem únicos a partir de canais de Ca²⁺ dependentes de voltagem em fibras musculares esqueléticas isoladas de murino.

Abstract

A fluorometria sítio-dirigida funcional tem sido a técnica de escolha para investigar a relação estrutura-função de numerosas proteínas de membrana, incluindo canais iônicos dependentes de voltagem. Esta abordagem tem sido usada principalmente em sistemas de expressão heteróloga para medir simultaneamente as correntes de membrana, a manifestação elétrica da atividade dos canais e medidas de fluorescência, relatando rearranjos de domínio local. A fluorometria sítio-dirigida funcional combina eletrofisiologia, biologia molecular, química e fluorescência em uma única técnica abrangente que permite o estudo de rearranjos estruturais em tempo real e função através de fluorescência e eletrofisiologia, respectivamente. Normalmente, essa abordagem requer um canal de membrana dependente de voltagem projetado que contenha uma cisteína que possa ser testada por um corante fluorescente reativo a tiol. Até recentemente, a química tiol-reativa utilizada para a marcação fluorescente sítio-dirigida de proteínas era realizada exclusivamente em oócitos e linhagens celulares de Xenopus , restringindo o escopo da abordagem a células primárias não excitáveis. Este relato descreve a aplicabilidade da fluorometria sítio-dirigida funcional em células musculares esqueléticas adultas para estudar os passos iniciais do acoplamento excitação-contração, o processo pelo qual a despolarização elétrica das fibras musculares está ligada à ativação da contração muscular. O presente protocolo descreve as metodologias para projetar e transfectar canais de Ca²⁺ voltagem-dependentes (Ca_V1.1) em fibras musculares do flexor curto dos dedos de camundongos adultos usando eletroporação in vivo e as etapas subsequentes necessárias para medidas funcionais de fluorometria sítio-dirigida. Esta abordagem pode ser adaptada para estudar outros canais iônicos e proteínas. O uso de fluorometria sítio-dirigida funcional do músculo de mamíferos é particularmente relevante para o estudo de mecanismos básicos de excitabilidade.

Introduction

A capacidade de rastrear rearranjos conformacionais de canais iônicos em resposta a um estímulo elétrico conhecido em uma célula viva é uma fonte de informações valiosas para a fisiologia^molecular1. Os canais iônicos dependentes de voltagem são proteínas de membrana que detectam mudanças na tensão transmembrana, e sua função também é afetada por mudanças de tensão². O desenvolvimento das técnicas de pinça de voltagem no século passado permitiu aos fisiologistas estudar, em tempo real, as correntes iônicas transportadas por canais iônicos dependentes de voltagem em resposta à despolarização da membrana3. O uso da tecnologia de pinça de voltagem tem sido crucial na compreensão das propriedades elétricas de células excitáveis, como neurônios e músculos. Na década de 1970, o refinamento das pinças de tensão permitiu a detecção de correntes de fechamento (ou movimento de carga) em canais de cálcio (Ca V) e sódio (Na_V) dependentes de tensão ^4,5. As correntes de gating são correntes capacitivas não-lineares que surgem do movimento de sensores de tensão em resposta a mudanças no campo elétrico através da membrana celular⁶. As correntes de gating são consideradas uma manifestação elétrica de rearranjos moleculares que precedem ou acompanham a abertura dos canais^iônicos7. Embora essas medições de corrente forneçam informações valiosas sobre a função do canal, tanto as correntes iônicas quanto as correntes de sincronização são leituras indiretas de rearranjos conformacionais inter e intramoleculares de canais dependentes de voltagem⁷.

A fluorometria sítio-dirigida funcional (FSDF; também conhecida como fluorometria de clamp de voltagem, VCF) foi desenvolvida no início^{da década de} 19908 e, pela primeira vez, forneceu a capacidade de visualizar diretamente as mudanças conformacionais locais e a função de uma proteína de canal em tempo real. Usando uma combinação de mutagênese de canais, eletrofisiologia e sistemas de expressão heteróloga, é possível marcar e rastrear fluorescentemente as partes móveis de canais ou receptores específicos em resposta ao estímulo ativador ^9,10. Esta abordagem tem sido extensivamente utilizada para estudar os mecanismos de detecção de tensão em canais iônicos dependentes de voltagem 8,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Para revisões autorizadas, ver 10,20,21,22,23.

Os canais Ca V e Na_V, críticos para a iniciação e propagação de sinais elétricos, são compostos por uma subunidade α1 principal, que possui um poro central e quatro domínios de detecção de tensão não idênticos². Além de sua estrutura primária distinta, os canais de Ca V e Na_V são expressos como complexos de multisubunidades com subunidades auxiliares²⁴. Os canais de potássio dependentes de voltagem (K V) consistem em quatro subunidades que se parecem com um único domínio de Na V ou Ca_V²⁵. A subunidade α1 formadora de poros e sensor de tensão dos canais de Ca V e Na_V é formada por um único polipeptídeo que codifica para quatro domínios individuais de seis segmentos transmembrana únicos (S1-S6; Figura 1A) ^24,26. A região composta pelos segmentos transmembrana de S1 a S4 forma o domínio de detecção de tensão (VSD) e os segmentos transmembrana de S5 e S6 formam o domínio de poros²⁶. Em cada CIV, a α-hélice S4 contém arginina ou lisina carregada positivamente (Figura 1A,B) que se movem em resposta à despolarização da membrana⁷. Várias décadas de pesquisa e os resultados de abordagens experimentais altamente diversas suportam a premissa de que os segmentos S4 se movem para fora, gerando correntes de fechamento, em resposta à despolarização da membrana⁶.

O FSDF mede as mudanças de fluorescência de um corante tiol-reativo conjugado a um resíduo específico de cisteína (isto é, a α-hélice S4) em um canal iônico ou outra proteína, projetada via mutagênese sítio-dirigida, à medida que o canal funciona em resposta à despolarização da membrana ou a outros estímulos¹⁰. De fato, o FSDF foi originalmente desenvolvido para investigar se o segmento S4 em canais de K_V, proposto para ser o principal sensor de tensão do canal, se move quando as cargas de gating se movem em resposta a mudanças no potencial de membrana ^8,10. No caso de canais iônicos dependentes de tensão, o FSDF pode resolver rearranjos conformacionais independentes dos quatro VSDs (rastreando um VSD a qualquer momento), simultaneamente com medições de função de canal. De fato, usando essa abordagem, demonstrou-se que as CIVs individuais parecem estar envolvidas diferencialmente em aspectos específicos da ativação e inativação do canal 12,27,28,29,30. A identificação da contribuição de cada VSD para a função dos canais é de alta relevância e pode ser usada para elucidar melhor a operação do canal e potencialmente identificar novos alvos para o desenvolvimento de fármacos.

O uso de FSDF em sistemas de expressão heteróloga tem sido extremamente útil para aprofundar nossa compreensão da função do canal a partir de uma perspectiva reducionista^10,23. Como muitas abordagens reducionistas, apresenta vantagens, mas também tem limitações. Por exemplo, uma grande limitação é a reconstituição parcial do nanoambiente do canal no sistema heterólogo. Frequentemente, os canais iônicos interagem com inúmeras subunidades acessórias e inúmeras outras proteínas que modificam sua função³¹. Em princípio, diferentes canais e suas subunidades acessórias podem ser expressos em sistemas heterólogos com o uso de múltiplas construções codificadoras de proteínas ou plasmídeos policistrônicos, mas seu ambiente nativo não pode ser totalmente reconstituído^30,32.

Nosso grupo publicou recentemente uma variante da FSDF em fibras musculares esqueléticas dissociadas nativas para o estudo dos passos iniciais do acoplamento excitação-contração (CCE)^33,34, processo pelo qual a despolarização elétrica das fibras musculares está ligada à ativação da contração^{muscular35,36}. Pela primeira vez, essa abordagem permitiu o rastreamento de movimento de sensores de tensão S4 individuais do canal Ca²⁺ do tipo L dependente de tensão (Ca_V1.1, também conhecido como DHPR) no ambiente nativo de uma fibra muscular diferenciada adulta³⁷. Isso foi conseguido considerando múltiplas características desse tipo celular, incluindo a atividade elétrica da célula permitindo a despolarização autopropagada induzida por estimulação rápida, a capacidade de expressar o plasmídeo de cDNA através da eletroporação in vivo, a alta expressão natural e organização compartimental dos canais dentro da célula, e sua compatibilidade com dispositivos de imagem de alta velocidade e gravação eletrofisiológica. Previamente, utilizamos um microscópio confocal de varredura de linha de alta velocidade como dispositivo de detecção³⁷. Agora, uma variação da técnica é apresentada usando um fotodiodo para aquisição do sinal. Este sistema de detecção baseado em fotodiodos poderia facilitar a implementação desta técnica em outros laboratórios.

Aqui, um protocolo passo-a-passo para utilizar FSDF em células nativas para o estudo do movimento individual do sensor de tensão de Ca_V1.1 é descrito. Embora o canal Ca_V1.1 tenha sido usado como exemplo ao longo deste manuscrito, esta técnica pode ser aplicada a domínios extracelularmente acessíveis de outros canais iônicos, receptores ou proteínas de superfície.

Protocol

Este protocolo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Maryland. O protocolo a seguir foi dividido em várias subseções, consistindo de (1) desenho de construto molecular e seleção de corante reagente de cisteína, (2) eletroporação in vivo , (3) dissecção muscular e isolamento de fibras, (4) descrição do setup de aquisição, (5) avaliação da atividade elétrica positiva da fibra e coloração de cisteína com proteína fluorescente verde (EGFP) aprimo…

Representative Results

Quando potenciais de ação propagadores são acionados em resposta à estimulação de campo repetitivo, é possível rastrear o movimento específico do sensor de voltagem em resposta a uma frequência específica de despolarização. Como mostrado na Figura 6A, o movimento das hélices marcadas com VSD-II pode ser rastreado em resposta a cada uma das duas despolarizações sucessivas aplicadas a 10 Hz (ou seja, espaçadas por 100 ms). O clareamento do sinal pode ser corrigido subtraindo-s…

Discussion

Aqui, um protocolo passo-a-passo para conduzir FSDF em fibras musculares para o estudo dos movimentos individuais do sensor de voltagem a partir do canal Ca_V1.1 é descrito. Embora o número de etapas e a diversidade de abordagens combinadas nesta técnica possam parecer complexas, a maioria dessas técnicas é frequentemente usada rotineiramente em laboratórios de biofísicos/biólogos celulares. Assim, a aparente complexidade reside principalmente na combinação de todas as várias abordagens em uma única…

Materials

Hyaluronidase	SIGMA ALDRICH	H3884-50mg
0.5 mL Eppendorf tube	Millipore Sigma	EP022363719-500EA
1 mL syringe	Millipore Sigma	Z683531-100EA	tuberculine slip tip
1/2” long 29-gauge sterile insulin needle and syringe	Becton Dikinson	324702
35 mm non coated plastic plate	Falcon, Corning	353001
60 mm non coated plastic plate	Falcon, Corning	351007
Alcoholic whip	PDI	B60307
Alexa-533 cube LP	Chroma	49907	Ex: 530/30x; BS: 532; Em: 550lp
Arc lamp	Sutter Instrumets	LB-LS 672
Artificial tears cream	Akorn	NDC 59399-162-35
Borosilicate glass Pasteur pipet 5 3/4"	VWR	14672-200
BTS (N-benzyl-p-toluene sulphonamide)	SIGMA ALDRICH	203895
collagenase type I	SIGMA ALDRICH	C0130-1g
Cotton tip	VWR	VWR-76048-960-BG
Double electrode array  (for electroporation)	BTX harvard apparatus	45-0120	10mm 2 needle array tips
EGFP cube	Chroma	39002AT	Ex: 480/30x; BS 505; Em: 535/40m
Electroporation apparatus device	BTX harvard apparatus	ECM 830
EPC10	HEKA Elektronik GmbH  (Harvard Bioscience)	895000
FBS	Biotechne,  R&D Systems	RND-S11150H	Fetal Bovine Serum – Premium, Heat Inactivated
glass coverslip 35 mm dish	MatTek Life Science	P35G-1.5-14-C
Isoflurane	Fluriso (Isoflurane) Liquid for Inhalation	502017-250ml
Isothermal heating pad	Braintree scientific inc	39DP
Laminin	Thermo Fisher	INV-23017015	Laminin Mouse Protein, Natural
Latex bulb	VWR	82024-554
LED 530 nm	Sutter Instrumets	5A-530
Low binding protein 0.2 μm sterile filter	Pall	FG4579	acrodisk  syringe filter 0.2um supor membrane low protein binding non pyrogenic
MEM	Invitrogen	INV-11380037
MTS-5-TAMRA	Biotium	89410-784	MTS-5-TAMRA
OriginPro Analysis Software	OriginLab Corporation	OriginPro 2022 (64-bit) SR1
Photodiode	Custom Made	NA
PlanApo 60x oil  1.4 N.A/∞/0.17	Olympus	BFPC2
Platinum wire 0.5 mm, 99.9 % metals basis	SIGMA	267228-1G	To manufacyte field stimulation electrode
Pulse Generator	WPI	Pulsemaster A300
Shutter drive controller	Uniblitz	100-2B
Shuttter	Uniblitz	VS2582T0-100
S-MEM	Invitrogen	INV-11380037
Sterile bench pad	VWR	DSI-B1623
Sterile saline	SIGMA ALDRICH	S8776
Sylgard 184 Silicone Elastomer kit	Dow Corning	1419447-1198
Vaporizer for Anesthesia	Parkland Scientific	V3000PK
Voltage generator	Custom Made	NA