Funktionell platsriktad fluorometri i nativa celler för att studera skelettmuskulaturens retbarhet

Summary

Funktionell platsstyrd fluorometri är en metod för att studera proteindomänrörelser i realtid. Modifiering av denna teknik för dess tillämpning i inhemska celler möjliggör nu detektering och spårning av enstaka spänningssensorrörelser från spänningsstyrda Ca²⁺ kanaler i murina isolerade skelettmuskelfibrer.

Abstract

Funktionell platsriktad fluorometri har varit den valda tekniken för att undersöka struktur-funktionsförhållandet mellan många membranproteiner, inklusive spänningsstyrda jonkanaler. Detta tillvägagångssätt har främst använts i heterologa expressionssystem för att samtidigt mäta membranströmmar, den elektriska manifestationen av kanalernas aktivitet och fluorescensmätningar, rapportera lokala domänomarrangemang. Funktionell platsriktad fluorometri kombinerar elektrofysiologi, molekylärbiologi, kemi och fluorescens till en enda omfattande teknik som möjliggör studier av strukturella omarrangemang och funktion i realtid genom fluorescens respektive elektrofysiologi. Vanligtvis kräver detta tillvägagångssätt en konstruerad spänningsstyrd membrankanal som innehåller ett cystein som kan testas med ett tiolreaktivt fluorescerande färgämne. Fram till nyligen utfördes den tiolreaktiva kemin som användes för den platsriktade fluorescerande märkningen av proteiner uteslutande i Xenopus-oocyter och cellinjer, vilket begränsade omfattningen av tillvägagångssättet till primära icke-exciterbara celler. Denna rapport beskriver tillämpligheten av funktionell platsriktad fluorometri i vuxna skelettmuskelceller för att studera de tidiga stegen i excitations-kontraktionskoppling, processen genom vilken muskelfiberelektrisk depolarisering är kopplad till aktiveringen av muskelkontraktion. Detta protokoll beskriver metoderna för att designa och transfektera cysteinkonstruerade spänningsstyrda Ca²⁺ kanaler (Ca_V1.1) till muskelfibrer i flexor digitorum brevis hos vuxna möss med hjälp av in vivo-elektroporering och de efterföljande stegen som krävs för funktionella platsriktade fluorometrimätningar. Detta tillvägagångssätt kan anpassas för att studera andra jonkanaler och proteiner. Användningen av funktionell platsriktad fluorometri av däggdjursmuskler är särskilt relevant för att studera grundläggande mekanismer för excitabilitet.

Introduction

Förmågan att spåra jonkanalskonformationella omarrangemang som svar på en känd elektrisk stimulans i en levande cell är en källa till värdefull information för molekylär fysiologi¹. Spänningsstyrda jonkanaler är membranproteiner som känner av förändringar i transmembranspänning, och deras funktion påverkas också av spänningsförändringar². Utvecklingen av spänningsklämtekniker under det senaste århundradet gjorde det möjligt för fysiologer att i realtid studera jonströmmar som bärs av spänningsstyrda jonkanaler som svar på membrandepolarisering³. Användningen av spänningsklämteknik har varit avgörande för att förstå de elektriska egenskaperna hos retbara celler som neuroner och muskler. På 1970-talet möjliggjorde spänningsklämförfining detektering av grindströmmar (eller laddningsrörelse) i spänningsstyrda kalcium (Ca V) och natrium (Na_V) kanaler ^4,5. Grindströmmar är icke-linjära kapacitiva strömmar som uppstår från spänningssensorernas rörelse som svar på förändringar i det elektriska fältet över cellmembranet⁶. Grindströmmar anses vara en elektrisk manifestation av molekylära omarrangemang som föregår eller åtföljer jonkanalöppning⁷. Medan dessa strömmätningar ger värdefull information om kanalens funktion, är både jonströmmar och grindströmmar indirekta avläsningar av inter- och intramolekylära konformationsomarrangemang av spänningsstyrda kanaler⁷.

Funktionell platsriktad fluorometri (FSDF; även kallad spänningsklämfluorometri, VCF) utvecklades i början av 1990-talet⁸ och gav för första gången möjlighet att direkt se lokala konformationsförändringar och funktionen hos ett kanalprotein i realtid. Med hjälp av en kombination av kanalmutagenes, elektrofysiologi och heterologa expressionssystem är det möjligt att fluorescerande märka och spåra de rörliga delarna av specifika kanaler eller receptorer som svar på den aktiverande stimulansen ^9,10. Detta tillvägagångssätt har använts i stor utsträckning för att studera spänningsavkänningsmekanismerna i spänningsstyrda jonkanaler 8,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. För auktoritativa recensioner, se 10,20,21,22,23.

Ca V- och Na_V-kanalerna, som är kritiska för initiering och utbredning av elektriska signaler, består av en huvud α1-underenhet, som har en central por och fyra icke-identiska spänningsavkänningsdomäner ². Förutom sin distinkta primära struktur uttrycks Ca V- och Na_V-kanaler som multisubenhetskomplex med hjälpunderenheter²⁴. Spänningsberoende kaliumkanaler (K V) består av fyra underenheter som ser ut som en enda domän av Na V eller Ca_V²⁵. Den porbildande och spänningsavkännande α1-underenheten i Ca V- och Na_V-kanaler bildas av en enda polypeptid som kodar för fyra individuella domäner med sex unika transmembransegment (S1-S6; Figur 1A) ^24,26. Regionen som består av S1 till S4 transmembransegment bildar spänningsavkänningsdomänen (VSD) och S5- och S6-transmembransegmenten bildar pordomänen²⁶. I varje VSD innehåller S4 α-helixen positivt laddat arginin eller lysin (figur 1A,B) som rör sig som svar på membrandepolarisering⁷. Flera decennier av forskning och resultaten från mycket olika experimentella metoder stöder förutsättningen att S4-segment rör sig utåt och genererar grindströmmar som svar på membrandepolarisering⁶.

FSDF mäter fluorescensförändringarna hos ett tiolreaktivt färgämne konjugerat till en specifik cysteinrest (dvs. S4 α-helixen) på en jonkanal eller annat protein, konstruerat via platsriktad mutagenes, eftersom kanalen fungerar som svar på membrandepolarisering eller andra stimuli¹⁰. Faktum är att FSDF ursprungligen utvecklades för att undersöka om S4-segmentet i K_V-kanaler, som föreslås vara kanalens huvudspänningssensor, rör sig när grindladdningarna rör sig som svar på förändringar i membranpotentialen ^8,10. Vid spänningsstyrda jonkanaler kan FSDF lösa oberoende konformationsomarrangemang av de fyra VSD:erna (spåra en VSD vid varje given tidpunkt), samtidigt med kanalfunktionsmätningar. Med hjälp av detta tillvägagångssätt har det faktiskt visat sig att enskilda varvtalsreglerare verkar vara olika involverade i specifika aspekter av kanalaktivering och inaktivering 12,27,28,29,30. Att identifiera varje VSD:s bidrag till kanalernas funktion är av hög relevans och kan användas för att ytterligare belysa kanaldriften och potentiellt identifiera nya mål för läkemedelsutveckling.

Användningen av FSDF i heterologa uttryckssystem har varit till stor hjälp för att främja vår förståelse av kanalfunktion ur ett reduktionistiskt perspektiv^10,23. Liksom många reduktionistiska tillvägagångssätt presenterar den fördelar men har också begränsningar. Till exempel är en stor begränsning den partiella rekonstitueringen av kanalnanomiljön i det heterologa systemet. Ofta interagerar jonkanaler med många tillbehörsunderenheter och många andra proteiner som modifierar deras funktion³¹. I princip kan olika kanaler och deras tillbehörsunderenheter uttryckas i heterologa system med användning av flera proteinkodande konstruktioner eller polycistroniska plasmider, men deras ursprungliga miljö kan inte rekonstitueras fullständigt^30,32.

Vår grupp publicerade nyligen en variant av FSDF i inhemska dissocierade skelettmuskelfibrer för studier av tidiga steg av excitationskontraktionskoppling (ECC) 33,34, processen genom vilken muskelfiberelektrisk depolarisering är kopplad till aktiveringen av muskelkontraktion ^35,36. För första gången tillät detta tillvägagångssätt rörelsespårning av enskilda S4-spänningssensorer från den spänningsstyrda L-typ Ca²⁺ -kanalen (Ca_V1.1, även känd som DHPR) i den ursprungliga miljön hos en vuxen differentierad muskelfiber³⁷. Detta uppnåddes genom att beakta flera egenskaper hos denna celltyp, inklusive cellens elektriska aktivitet som möjliggör snabb stimuleringsinducerad självförökad depolarisering, förmågan att uttrycka cDNA-plasmid genom in vivo-elektroporering, det naturliga höga uttrycket och kompartmentorganisationen av kanalerna i cellen och dess kompatibilitet med höghastighetsavbildning och elektrofysiologiska inspelningsenheter. Tidigare använde vi ett höghastighetslinjeskanningskonfokalmikroskop som detekteringsenhet³⁷. Nu presenteras en variant av tekniken med hjälp av en fotodiod för signalinhämtning. Detta fotodiodbaserade detektionssystem kan underlätta implementeringen av denna teknik i andra laboratorier.

Här beskrivs ett steg-för-steg-protokoll för att använda FSDF i nativa celler för studier av individuell spänningssensorrörelse från Ca_V1.1. Medan Ca_V1.1-kanalen har använts som ett exempel i hela detta manuskript, kan denna teknik tillämpas på extracellulärt tillgängliga domäner av andra jonkanaler, receptorer eller ytproteiner.

Protocol

Detta protokoll godkändes av University of Maryland Institutional Animal Care and Use Committee. Följande protokoll har delats in i flera underavsnitt, bestående av (1) molekylär konstruktionsdesign och cysteinreagerande färgval, (2) in vivo-elektroporering, (3) muskeldissektion och fiberisolering, (4) beskrivning av förvärvsinställning, (5) bedömning av förstärkt grönt fluorescerande protein (EGFP) positiv fiberelektrisk aktivitet och cysteinfärgning, och (6) signalförvärv och bearbetning. Dessut…

Representative Results

När förökningspotentialer utlöses som svar på repetitiv fältstimulering är det möjligt att spåra specifik spänningssensorrörelse som svar på en specifik frekvens av depolarisering. Som visas i figur 6A kan rörelsen hos VSD-II-märkta helixer spåras som svar på var och en av två på varandra följande depolarisationer applicerade vid 10 Hz (dvs. med 100 ms mellanrum). Signalblekning kan korrigeras genom att subtrahera baslinjen till spåret (figur 6B</stro…

Discussion

Här beskrivs ett steg-för-steg-protokoll för att genomföra FSDF i muskelfibrer för studier av individuella spänningssensorrörelser från Ca_V1.1-kanalen. Även om antalet steg och mångfalden av tillvägagångssätt som kombineras i denna teknik kan verka komplexa, används de flesta av dessa tekniker ofta rutinmässigt i biofysiker / cellbiologlaboratorier. Således ligger den uppenbara komplexiteten huvudsakligen i kombinationen av alla olika tillvägagångssätt i en enda integrerad teknik. Ofta när …

Materials

Hyaluronidase	SIGMA ALDRICH	H3884-50mg
0.5 mL Eppendorf tube	Millipore Sigma	EP022363719-500EA
1 mL syringe	Millipore Sigma	Z683531-100EA	tuberculine slip tip
1/2” long 29-gauge sterile insulin needle and syringe	Becton Dikinson	324702
35 mm non coated plastic plate	Falcon, Corning	353001
60 mm non coated plastic plate	Falcon, Corning	351007
Alcoholic whip	PDI	B60307
Alexa-533 cube LP	Chroma	49907	Ex: 530/30x; BS: 532; Em: 550lp
Arc lamp	Sutter Instrumets	LB-LS 672
Artificial tears cream	Akorn	NDC 59399-162-35
Borosilicate glass Pasteur pipet 5 3/4"	VWR	14672-200
BTS (N-benzyl-p-toluene sulphonamide)	SIGMA ALDRICH	203895
collagenase type I	SIGMA ALDRICH	C0130-1g
Cotton tip	VWR	VWR-76048-960-BG
Double electrode array  (for electroporation)	BTX harvard apparatus	45-0120	10mm 2 needle array tips
EGFP cube	Chroma	39002AT	Ex: 480/30x; BS 505; Em: 535/40m
Electroporation apparatus device	BTX harvard apparatus	ECM 830
EPC10	HEKA Elektronik GmbH  (Harvard Bioscience)	895000
FBS	Biotechne,  R&D Systems	RND-S11150H	Fetal Bovine Serum – Premium, Heat Inactivated
glass coverslip 35 mm dish	MatTek Life Science	P35G-1.5-14-C
Isoflurane	Fluriso (Isoflurane) Liquid for Inhalation	502017-250ml
Isothermal heating pad	Braintree scientific inc	39DP
Laminin	Thermo Fisher	INV-23017015	Laminin Mouse Protein, Natural
Latex bulb	VWR	82024-554
LED 530 nm	Sutter Instrumets	5A-530
Low binding protein 0.2 μm sterile filter	Pall	FG4579	acrodisk  syringe filter 0.2um supor membrane low protein binding non pyrogenic
MEM	Invitrogen	INV-11380037
MTS-5-TAMRA	Biotium	89410-784	MTS-5-TAMRA
OriginPro Analysis Software	OriginLab Corporation	OriginPro 2022 (64-bit) SR1
Photodiode	Custom Made	NA
PlanApo 60x oil  1.4 N.A/∞/0.17	Olympus	BFPC2
Platinum wire 0.5 mm, 99.9 % metals basis	SIGMA	267228-1G	To manufacyte field stimulation electrode
Pulse Generator	WPI	Pulsemaster A300
Shutter drive controller	Uniblitz	100-2B
Shuttter	Uniblitz	VS2582T0-100
S-MEM	Invitrogen	INV-11380037
Sterile bench pad	VWR	DSI-B1623
Sterile saline	SIGMA ALDRICH	S8776
Sylgard 184 Silicone Elastomer kit	Dow Corning	1419447-1198
Vaporizer for Anesthesia	Parkland Scientific	V3000PK
Voltage generator	Custom Made	NA