Method Article

Rho1介导的肌动肌蛋白收缩力的光遗传学抑制与 果蝇 胚胎上皮张力的测量

DOI:

10.3791/65314

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April 14th, 2023

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Dartmouth College, 2School of Life Sciences, Westlake University, 3Department of Molecular Biology, Princeton University

In This Article

Summary

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肌动肌蛋白收缩力在细胞和组织形态发生中起重要作用。然而，在 体内 急性操纵肌动肌蛋白收缩力具有挑战性。该协议描述了一种光遗传学系统，该系统可快速抑制 果蝇 胚胎中Rho1介导的肌动肌蛋白收缩力，揭示了 体内肌动球蛋白失活后上皮张力的立即丧失。

Abstract

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肌动蛋白和非肌球蛋白II产生的收缩力（"肌动肌蛋白收缩力"）对于细胞和组织在多个长度尺度上的形态变化至关重要，例如细胞分裂，细胞迁移，上皮折叠和分支形态发生。深入了解肌动球蛋白收缩性在形态发生中的作用需要允许快速灭活肌动球蛋白的方法，这是使用传统的遗传学或药理学方法难以实现的。所提出的协议展示了使用基于CRY2-CIBN的光遗传学二聚化系统Opto-Rho1DN通过精确的时间和空间控制来抑制 果蝇 胚胎中的肌动球蛋白收缩力。在该系统中，CRY2融合到Rho1（Rho1DN）的主要负形式，而CIBN锚定在质膜上。蓝光介导的CRY2和CIBN二聚化导致Rho1DN从细胞质快速转移到质膜，在那里它通过抑制内源性Rho1使肌动球蛋白失活。此外，本文还提出了将Opto-Rho1DN介导的肌动球蛋白失活与激光消融偶联的详细方案，以研究肌动肌蛋白在 果蝇 腹侧沟形成过程中产生上皮张力中的作用。该协议可以应用于许多其他形态过程，这些过程涉及 果蝇 胚胎中的肌动肌收缩性，只需最少的修改。总体而言，这种光遗传学工具是剖析动态组织重塑过程中肌动肌蛋白收缩力在控制组织力学中的功能的有力方法。

Introduction

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肌动蛋白收缩力是非肌肉肌球蛋白II（以下简称"肌球蛋白"）对F-肌动蛋白网络施加的收缩力，是改变细胞形状和驱动组织水平形态发生的最重要力量之一1,2。例如，上皮细胞顶端结构域肌动蛋白收缩性的激活导致顶端收缩，这促进了各种形态发生过程，包括上皮折叠、细胞挤出、分层和伤口愈合 3,4,5,6,7.肌球蛋白的活化需要其调节轻链的磷酸化。这种修饰减轻了肌球蛋白分子的抑制构象，使它们能够形成两端具有多个头部结构域的双极肌球蛋白丝束。双极肌球蛋白丝驱动肌动蛋白丝的反平行运动并产生收缩力1,8,9。

进化上保守的Rho家族小GTP酶RhoA（果蝇中的Rho1）在各种细胞环境中的肌动肌蛋白收缩力的激活中起核心作用10....

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Protocol

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1.设置遗传杂交并准备卵子收集杯

  1. 从光遗传系UASp-CIBNpm（I）中选择雌性苍蝇（处女）;UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry（III）在体视显微镜下的CO2 垫上，并与来自母体GAL4驱动线67 Sqh-mCherry的雄性苍蝇建立杂交;15 E-钙粘蛋白-GFP。
    注意:67和15代表插入第二（II）和第三（III）染色体的母体-微管蛋白-GAL4，分别为52。该协议中使用的GAL4系还表达mCherry标记的肌球蛋白调节轻链Sqh（意大利面南瓜）37 和GFP标记的E-钙粘蛋白53。来自光遗传系的苍蝇可能仍含有FM7和TM6平衡染色体。来自母体GAL4驱动系的苍蝇可能仍含有CyO和TM3平衡染色体。
  2. ~10天后，选择具有以下基因型的F1雌性苍蝇:UASp-CIBNpm/+;67 平方/小时樱桃/+;15 E-钙粘蛋白-GFP/UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry。与雄性苍蝇一起设置一个鸡蛋收集杯。
    1. 确保具有正确基因型的雌性果蝇不包含任何平衡染色体（即，它们不应包含卷曲的翅膀[Cy]，短刚毛[Sb]，条形或肾形眼睛[B]或额外的肱骨刚毛[Hu]），这些染色体分别是用于产生....

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Results

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在经历顶端收缩的未刺激胚胎中，Sqh-mCherry在腹侧中胚层细胞的中尖区域富集，而CRY2-Rho1DN-mCherry是胞质的（图1A）。收缩域内的激光消融导致沿A-P轴的快速组织反冲（图1B，C）。在受刺激的胚胎中，CRY2-Rho1DN-mCherry信号变得质膜定位，而Sqh-mCherry的中等神经质地信号完全消失（图1A）。受刺激胚胎中的激光消融不会导致明显的组织后坐力，如图1B，C所示，并在图1D中量化。这些结果表明，组织张力的产生需要活性顶端肌动蛋白收缩力;当肌动球蛋白在Rho1抑制下变得无活性时，顶端组织张力也降低41。这些观察结果与先前的发现一致，即腹侧中胚层细胞中顶端肌球蛋白收缩力的激活导致胚胎腹面组织.......

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Discussion

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该协议描述了光遗传学和激光消融的组合使用，以在肌动肌蛋白收缩性失活后立即探测组织张力的变化。这里描述的光遗传学工具利用Rho1（Rho1DN）的主要阴性形式来急性抑制内源性Rho1和Rho1依赖性肌动肌素收缩力。先前在果蝇腹侧沟形成背景下对Opto-Rho1DN的表征表明，该工具通过同时肌球蛋白失活和肌动蛋白拆卸来介导顶端肌动肌蛋白收缩力的快速失活非常有效41。特别是，在顶端收缩时对胚胎的刺激导致在经历顶端收缩的细胞中60秒内根尖肌球蛋白信号降低41。Rho1抑制时皮质肌球蛋白的快速去除可能是由于Rho1和肌球蛋白通过活性和非活性状态的快速循环，这是由GTP酶激活蛋白（GAPs）对Rho1和肌球蛋白轻链磷酸酶的活性引起的，分别19,54。与对肌动肌蛋白的影响一致，将光遗传学与激光消融相结合表明，顶端收缩期间的Opto-Rho1DN刺激导致胚胎腹侧区域的上皮张力立即丧失41<.......

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Disclosures

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作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可以解释为潜在的利益冲突。

Acknowledgements

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作者感谢Ann Lavanway的成像支持。作者感谢Wieschaus实验室和De Renzis实验室共享试剂，并感谢Bloomington果蝇种群中心共享苍蝇种群。这项研究得到了NIGMS ESI-MIRA R35GM128745和美国癌症协会机构研究资助 #IRG-82-003-33的支持。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
35 mm 玻璃底培养皿MatTekP35G-1.5-10-C用于样品制备
60 mm & 15 mm 带盖培养皿Falcon351007用于样品制备
用于覆盖显微镜的黑布在线NA用于避免不必要的光刺激
Clorox Ultra Germicadal 漂白剂（8.25% 次氯酸钠）VWR10028-048用于胚胎去绒毛膜
CO2 垫Genesee Scientific59-114用于交叉设置
ddH2ONANA用于样品制备
Dumont Style 5 镊子VWR102091-654用于样品制备
睫毛工具（由纯红色紫貂圆刷 #2 制成）VWR22940-834用于样品制备
FluoView（软件）OlympusNA用于图像采集和光遗传学刺激
卤烃油 27Sigma AldrichH8773-100ML用于胚胎阶段可视化
ImageJ/FIJINIHNA用于图像分析
MATLABMathWorksNA用于图像分析
尼康 SMZ-745 立体镜尼康NA用于样品制备
奥林巴斯 FVMPE-RS 多光子显微镜配备 InSight DS 双线超快激光器，用于同步双波长多光子成像，25x/NA1.05 水浸物镜 （XLPLN25XWMP2） 和用于光活化/刺激的 IR/VIS 刺激装置。该系统还配备了 TRITC 过滤器（39005-BX3;AT-TRICT-REDSHFT 540/25x、565BS、620/60M）和发射白光的荧光照明装置。OlympusNA用于图像采集和光遗传学刺激
SP Bel-Art 100 位聚丙烯冷冻储存盒（用于样品转移的黑色避光盒）VWR30621-392用于避免不需要的光刺激
用于 FM1403 荧光灯的紫外线滤光罩（橙红色塑料罩）玻利光学FM14036151用于避免不需要的
光刺激VITCHELO V800 带白色和红色 LED 灯的前照灯AmazonNA用于避免不必要的光刺激

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vicente-Manzanares, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Horwitz, A. R. Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (11), 778-790 (2009).
  2. Munjal, A., Lecuit, T. Actomyosin networks and tissue morphogenesis.

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Optogenetic InhibitionActomyosin ContractilityEpithelial TensionDrosophila EmbryosRho1 InhibitionLaser AblationTissue MorphogenesisVentral Furrow FormationCRY2 CIBN SystemApical Constriction

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